Исследуя одну молекулу адгезии методом атомно-силовой микроскопии
Summary
A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.
Abstract
Атомно-силовая спектроскопия является идеальным инструментом для изучения молекул на поверхностях и границах. Экспериментальный протокол для соединения большой выбор одиночных молекул ковалентно на иглой АСМ представлена. В то же время наконечник АСМ пассивируются для предотвращения неспецифических взаимодействий между зондом и подложкой, которая является необходимым условием для изучения одиночных молекул, прикрепленного к кончику АФМ. Анализы для определения силу адгезии, длина адгезию, и свободной энергии этих молекул на поверхности твердых тел и био-интерфейсов в ближайшее время представлены и внешние ссылки для дальнейшего чтения предусмотрены. Пример молекулы поли (аминокислоты) polytyrosine, привитой полимер PI-г -PS и фосфолипид POPE (1-пальмитоил-2-oleoyl- SN глицеро-3-фосфоэтаноламин). Эти молекулы десорбируются с различных поверхностей, таких как CH 3 -SAMs, водорода прекращается алмаза и поддерживается бислоев при различных условиях растворителя. И, наконец,Преимущества силовых спектроскопических отдельных экспериментов молекулы рассматриваются в том числе средства, чтобы решить, если действительно одна молекула была изучена в эксперименте.
Introduction
За последние 30 лет, атомно-силовая микроскопия (АСМ) оказалась ценным методом визуализации для изучения биологических 1,2 и синтетические 3 материалов и поверхностей, так как он обеспечивает молекулярную пространственное разрешение во всех трех измерениях и может эксплуатироваться в различных растворителя окружающая среда. Кроме того, АСМ-сингл сила молекула спектроскопии (ОВС) позволяет измерять силы, начиная от ПШ Мп режим и дал беспрецедентный понимание например в сворачивания белка 4,5, физике полимеров 6 – 8, и одного взаимодействия молекула-поверхность 9 – 12 .The обоснование изучения отдельными молекулами, а не ансамбля молекул, чтобы избежать среднем эффекты, которые часто маскируют редкие события или скрытые молекулярных состояний. Кроме того, множество молекулярных параметров, таких как длина контура, длина Кун, адгезии свободной энергии и т.д., могут бытьполучены. Это подробно описано в приведенных ниже примерах. В типичном эксперименте АСМ-ОВС, молекула зонда соединен с очень острым концом с помощью линкерной молекулы. Сам наконечник расположен в конце гибкой консоли. Если кончик приводится в контакт с поверхностью молекула зонда будут взаимодействовать с этой поверхностью. Наблюдая за отклонение кантилевера от втягивания зонда, силы, и, следовательно, свободной энергии, чтобы отделить молекулы с поверхности может быть определена. Чтобы получить значимые статистические данные, большое количество так называемых силовых кривых должны быть приобретены. Кроме того, чтобы иметь истинные эксперименты одной молекулы (т.е. с использованием одного и того же молекулы-зонда в течение продолжительности всего эксперимента) молекула зонда должна быть ковалентно соединенный с иглой АСМ. Здесь экспериментальный протокол для консольной функционализации с одной молекулой посредством ковалентной связи представлена. Одна молекула может быть либо в сочетании с помощью амино или тиол группы к кончику АФМ. Процесс сопряжения может быть выполнена в широком разнообразии растворителей (органической и водной) для учета сольватации свойств полимеров, используемых.
В первой части, общий протокол для ковалентного присоединения одной молекулы ("молекулы зонда") с помощью линкерной молекулы наконечником АСМ описан. С этой целью, органические NHS- или малеимид-химии используется 13. Наряду с протоколом в течение трех молекул, например, процессы сбора данных и анализа данных описана и ссылки для дальнейшего чтения предоставляются. Примерные молекулы: (линейный) полимер тирозин, привитой полимер PI-г -PS и липидов Папы Римского. Это включает в себя небольшие изменения протокола, например, ковалентно присоединить цистеина. Кроме того, раздел посвящен подготовке различных поверхностей, таких как поверхности алмаза, СН 3 -самосопряженных монослоя и липидного бислоя. Эти интерфейсы имеют прован быть хорошие ссылки и примеры.
Protocol
Representative Results
Discussion
В течение последних десятилетий, одиночные эксперименты молекулы обеспечили беспрецедентный понимание молекулярных механизмов и оказалось бесценным подход в области наук о жизни и за ее пределами. Для достижения хороших и значимой статистики из ОВС экспериментов, в идеале один и тот…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the DFG (Hu 997/2-2) for financial support. FS acknowledges the Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr was supported by the Elitenetzwerk Bayern in the framework of the doctorate program Material Science of Complex Interfaces. SKi thanks the SFB 863 for financial support.
Materials
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35 %), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9 %) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5 %) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
References
- Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
- Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).
- Magonov, S. N. Atomic Force Microscopy in Analysis of Polymers. Encyclopedia of Analytical Chemistry. , (2006).
- Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nature Structural Biology. 6 (4), 346-349 (1999).
- Li, H., Linke, W. a., et al. Reverse engineering of the giant muscle protein titin. Nature. 418 (6901), 998-1002 (2002).
- Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. Single-molecule studies of DNA mechanics. Current opinion in structural biology. 10 (3), 279-285 (2000).
- Zhang, W., Zhang, X. Single molecule mechanochemistry of macromolecules. Progress in Polymer Science. 28 (8), 1271-1295 (2003).
- Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 048301 (2005).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction – The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid Ordered and Liquid Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), (2014).
- Pirzer, T., Hugel, T. Adsorption mechanism of polypeptides and their location at hydrophobic interfaces. Chemphyschem. 10 (16), 2795-2799 (2009).
- Butt, H. -. J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1-152 (2005).
- Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Copolymer to Gold. ACS NANO. 6 (12), 10735-10742 (2012).
- Hermanson, G. . Bioconjugate Techniques. , (1996).
- Kienle, S., et al. Effect of molecular architecture on single polymer adhesion. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (15), 4351-4357 (2014).
- Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1995).
- Dankerl, M., et al. Diamond Transistor Array for Extracellular Recording From Electrogenic Cells. Advanced Functional Materials. 19 (18), 2915-2923 (2009).
- Leonenko, Z. V., Carnini, A., Cramb, D. T. Supported planar bilayer formation by vesicle fusion: the interaction of phospholipid vesicles with surfaces and the effect of gramicidin on bilayer properties using atomic force microscopy. Biochimica et biophysica acta. 1509 (1-2), 131-147 (2000).
- Stetter, F. W. S., Hugel, T. The Nanomechanical Properties of Lipid Membranes are Significantly Influenced by the Presence of Ethanol. Biophysical Journal. 104 (5), 1049-1055 (2013).
- Putman, C. A. J., De Grooth, B. G., Hulst, N. F., Greve, J. A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy. Journal of Applied Physics. 72 (1), 6-12 (1992).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64 (7), 1868 (1993).
- Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
- Li, I. T. S., Walker, G. C. Interfacial free energy governs single polystyrene chain collapse in water and aqueous solutions. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6530-6540 (2010).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
- Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).
- Ebner, A., et al. Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy. Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).
- Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
- Morfill, J., et al. Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy. Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).
