EPA Метод 1615. Измерение энтеровирус и Норовирус встречаемости в воде культуры и РТ-КПЦР. II. Итого культивируемых Вирус Анализ

Примечание: Пожалуйста, смотрите раздел дополнительного материалы S1 для списка определений. Процедуры по контролю качества, связанные с ЮСЕПА Method 1615, описаны в разделе S2 дополнительные материалы. 1. Фильтр Элюирование Процедура Первый Элюирование Поместите 500 мл забуференного 1,5% мясного экстракта, рН 9,0, нагревают до комнатной температуры в градуированный цилиндр. Открыть фильтр корпус картриджа и добавить достаточное количество говяжьего экстракта, чтобы полностью покрыть электроположительную фильтр. Заменить крышку корпуса фильтра и залить оставшейся говяжьего экстракта в стерильный стакан. Через 1 мин после времени контакта, пройти раствор экстракта говядины в корпусе вместе с тем, оставаясь в стерильном стакане медленно через фильтр с использованием контейнера под давлением или перистальтического насоса. Соберите элюат в стеклянный стакан 2 л. Во-вторых элюирования Повторите шаги 1.1 с использованием дополнительно 500 мл забуференного 1,5% говяжьего экстракта, Но увеличивает время контакта на шаге 1.1.2 до 15 мин. Добавьте экстракт говядины из второго элюции до 2 л стакан, содержащий, что с первого элюирования. Добавьте стерильную мешалку в стакан. 2. Органические Флокуляция Процедура Концентрация Стерилизовать рН-электрод комбинированного типа с 0,525% раствором гипохлорита натрия в течение не менее 5 мин. Ополосните электрод стерильной дН 2 O , а затем дехлорирования с 0,05 М раствором тиосульфата натрия. Калибровка рН-метр с использованием рН 4 и 7 стандартов. Поместите химический стакан, содержащий элюата на мешалке. Включите пластину и увеличить скорость перемешивания до тех пор, пока вихрь формируется. Доводят рН элюата до 3,5 ± 0,1, медленно по каплям добавлением 1,2 М HCl в элюат. Добавьте HCl по каплям, потому что быстрое добавление инактивирует вирус. За это время элюат станет облачный как осадок начинает формироваться. Снизить смешивания спее изд к медленному размешать и затем продолжать контролировать и поддерживать рН элюата при 3,5 ± 0,1 при комнатной температуре в течение 30 мин. Налейте осажденного экстракт говядины суспензии в одну или несколько центрифуг бутылок и центрифуги в течение 15 мин при 2500 мкг при 4 ° С. Удалить бутылки из центрифуги и либо аспирата или медленно сливают надосадочную жидкость, чтобы предотвратить потерю осажденной осадка. Удалите супернатант. ПРИМЕЧАНИЕ: Там может быть значительные различия между говяжьего экстракта партиями в количестве и качестве осадка. Осадок получают из некоторых партий будет растворяться быстро в то время как из других партий растворяется с трудом. Добавить 30 мл 0,15 М фосфата натрия в центрифуге бутылку, содержащую осадок. С помощью 0,15 М фосфат натрия, рН 9,0 для осаждается из говядины экстракта партий, которые растворяют в течение 5 мин. Смесь перемешивают в течение 10 мин после того, как осадок полностью растворяется, а затем сразу перейти к этапу 2.7. С помощью 0,15 М фосфата натрия, рН 7,0-7,5 для всех остальных преципитатов. Смесь перемешивают в течение 10-15 мин, чтобы растворить, или для более сложных преципитатов, разбить их с помощью стерильного шпателя, Повторным извлечением раствора вверх и вниз во время перемешивания с пипеткой, при встряхивании осадок при 160 оборотах в минуту на орбитальном шейкере, или с помощью комбинации этих процедур. ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании более одной центрифуги бутылку, объединить осаждается с использованием менее 30 мл фосфата натрия, а затем использовать оставшуюся часть 30 мл, чтобы ополоснуть бутылки после объединения осаждается в одну бутылку или стакан. Если объединенный осадок в плоским дном бутылки центрифуге, добавьте мешалку к бутылке. Переходите к этапу 2.6.5. Если объединенный осадок в центрифуге бутылки с коническим дном, перенести его в маленький стекл нный стакан и добавить мешалку в стакан. Поместите бутылку или стакан на магнитной мешалкой, и размешать до прecipitate растворится полностью. Повторно стерилизовать рН электрода комбинационного типа с 0,525% раствором гипохлорита натрия и дехлорирование с тиосульфатом натрия 0,05 М, как описано в шаге 2.1. Калибровка рН-метр с использованием рН 7 и 10 стандартов. Медленно довести рН полностью растворенного осадка до 9,0 1 М NaOH, а затем перемешивали в течение 10 мин. Снимите мешалку и центрифугировать растворенного осадка в течение 10 мин при 4,000-10,000 XG и 4 ° С. Осторожно вылить надосадочную жидкость в стеклянный стакан, не нарушая гранул. Добавьте мешалку в стакан и выбросить осадок. Стакан помещают на магнитную мешалку, и перемешивать раствор. Добавить 1,2 M HCl по каплям для доведения рН до 7,0-7,5. Фильтр стерилизовать жидкости над осадком путем пропускания через стерилизующий фильтр, содержащий предварительный фильтр, который предварительно обрабатывали 15 мл говяжьего экстракта 1,5%, 0,05 М глицина, рН 7.0-7.5. Анализ образца Volumе (б) расчеты: Используйте Уравнение 1 для вычисления S для всех испытательных образцов, за исключением лаборатории Укрепленный Бланк и лабораторию реагентного бланка, Уравнение 1 где D (объем исходного образца Water, проанализированных) составляет 500 л для грунтовых вод, TSV (Общий Объем образца) является объем поля образца, прошедшего через 5-дюймового электроположительны картриджа фильтра, полученного в лаборатории, и FCSV (Final Концентрированный Объем образца) является объем после фильтрации в шаге 2.10. Пример приведен в дополнительном разделе материалы S4.1. Вычислить S для лаборатории укрепленных Blank (LFB, то есть положительный контроль качества с использованием посеяны воды класса реагентов) и Lab реагентного бланка (LRB, то есть отрицательного контроля качества с использованием реагента класса воды) путем умножения FCSV на 0,3. Разделите FCSV в THREе подвыборки. Подготовьте подвыборках 1 и 2 с объемом , равным 1,04 раза пробирной Объем образца. Замораживание этих подвыборок на уровне или ниже -70 ° С, если они не могут быть проанализированы с помощью общего культивируемых анализа вируса (подвыборки 1, стадия 4), или обработанные для молекулярных анализов (не показаны) в течение 24 ч; в противном случае, проводить при температуре 4 ° С. Замораживание оставшийся объем (подвыборки 3) на уровне или ниже -70 ° C. Вычислить объем посевного материала путем деления S на 10. 3. Общая культивируемых Вирус квантовом Анализ Примечание: Для всех шагов всегда добавляют решения осторожно, чтобы не нарушать клеточный монослой. Слейте или аспирата средств массовой информации из испытательных сосудов, содержащих монослой клеток BGM на 3-6 суток от расщепления, а затем добавить объем сбалансированного солевого раствора, равного средства массовой информации удалены. Слейте или аспирата сбалансированный солевой раствор из клеточной культуры тэй сосуды используются, а затем прививают испытательные сосуды культуры клеток Привить 10 тестовых сосудов для каждого испытуемого образца с объемом подвыборки 1 равен объему посевного материала наряду с общим культивируемых вируса управления анализа квантовых (дополнительные материалы раздела S2.4). Для LFB и Lab крепленое Образец матрицы (LFSM, то есть высевают воды матрица образца), готовят 5-, 25- и 125-кратное разбавление с использованием подвыборки 3 и 0,15 М фосфата натрия, рН 7,0-7,5 в качестве разбавителя. Пример процедуры для изготовления разведений приведено в дополнительном материалы раздела S3. Инокулируйте 10 промытых испытательными сосудами культивирования клеток для каждой серии разведений с использованием Volume посевного материала на каждом испытательном сосуде , в дополнение к судам , привитых неразбавленного подвыборки 1 на этапе 3.2.1. Для любого испытуемого образца из стадии 3.2.1 (кроме тех, которые высевали на этапе 3.2.2), который имеет ЦПЭ во всех 10 повторах после 14 дней инкубации (см Шаг 3.3), предварительностричь 5-, 25- и 125- и 625-кратные разведения подвыборки 3. Инокулировать 10 промывают испытательные сосуды культуры клеток для каждой серии разведений с использованием Volume инокулята на каждом испытательном сосуде вместе с новым набором общего культивируемых вируса квантовом управления анализа (дополнительные материалы раздела S2.4). Распределить прививочный материал по поверхности клеточных монослоев путем наклона сосуды назад и вперед. Выдержите в испытательные сосуды при комнатной температуре в течение 80-120 мин на механической качающейся платформе при 1-5 колебаний / мин или с качанием сосудов каждые 15-20 мин, чтобы позволить любому вирусу присутствует адсорбироваться на клетках. Добавить предварительно нагретую среду технического обслуживания, а затем инкубировать испытательные сосуды при 36,5 ± 1 ° C. Посмотрите на появление ЦПЭ в каждом испытательном сосуде с помощью микроскопа ежедневно в течение первых 3 дней, а затем изучить их каждые 2-3 дня до дня 14. Передача любых испытаний судов, которые показывают ≥75% ЦПЭ в морозильной камере установлен на уровне илиниже -70 ° C. Заморозить все остальные культуры и общее число культивируемых вируса квантовом управления опробования на уровне или ниже -70 ° C после изучения судов в последний день. Разморозить все культуры и фильтровать ≥15% от измеряемой среды от каждого CPE-положительного испытательного сосуда через стерилизующий фильтр 0,2 мкм. Если указанный объем не может быть пропущен через фильтр из-за закупоривания, центрифугу среды в течение 10 мин при 1,500-18,000 XG и 4 ° С перед фильтрацией. Выполните второй проход всех 1 – й тест прохода судов с использованием отмытых тестовых сосудов фоновой музыки. Привить новые тестовые сосуды с объемом модифицирования, что составляет 10% от талой среды от всех негативных испытаний сосудов и из фильтруемой среды из положительных сосудов. Повторите шаги 3.2.4-3.4.3, но заморозить любой испытательный сосуд , который был отрицательным на 1 – й проход и положительный результат на 2 – й , как описано в шаге 3.3. Выполните 3 – й проходвозраст , как описано для 2 – го прохода с использованием только отрицательных контролей этого анализа и клеточных культур , которые были отрицательными в течение 1 – го прохода и положительным во 2 – й проход. Определение индивидуальных испытаний сосудов как вирус положительной , когда они показывают ЦПЭ в обоих 1 – го и 2 – го каналов или, в случае , когда CPE не происходит до 2 – го прохода в обоих 2 – й и 3 – й каналы. Используйте наиболее вероятное число Калькулятор с информации ЮСЕПА настройки программы по умолчанию , установленные , как показано в таблице S2 для расчета вирусные титры всех тестовых образцов. Введите число вирусных положительный тест дублирующих сосудов с шагом 3.6 для каждого испытуемого образца в калькулятор , чтобы определить значение / мл MPN (М мл) и верхний (CL УЯМ) и более низкие 95% доверительные пределы значений (CL LML) / мл , Оbtain в / значение L MPN (M L) соответствующего испытуемого образца с использованием уравнения 2. Уравнение 2 M мл является значение / мл MPN на шаге 3.7, S является пробирного Объем образца, а D является объем исходного образца Water , проанализированных. Вычислить верхний доверительный предел / L, подставив значение CL УЯМ для значения M мл. Вычислить нижний доверительный предел / L, подставив значение CL LML для значения M мл. Расчет Пример показан в дополнительном разделе материалы S4.2. Значения Отчет M мл 0 , как ≤ 1 / D. Например, ≤ 0,002 MPN / л (≤ 1/500 L) для проб подземных вод. Вычислить предел достоверности значения MPN и 95% для каждой лаборатории крепленое Бланк и Lab Reагент Blank сначала умножением значения / мл , полученные в калькуляторе по S , а затем разделив результат на 0,3.