EPA Método 1615. A medição do Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. II. De ensaio total de Vírus cultiváveis

NOTA: Por favor, consulte a secção materiais complementares S1 para uma lista de definições. Os procedimentos de controle de qualidade associadas com o método EPA 1615 estão descritos na secção de materiais suplementares S2. 1. Filtro de eluição Procedimento primeiro eluição Coloque 500 ml de extracto de carne a 1,5% tamponado, pH 9,0, aquecida até à temperatura ambiente num cilindro graduado. Abrir o alojamento do cartucho de filtro e adicionar uma quantidade suficiente de extracto de carne para cobrir o filtro electropositivo completamente. Substitua a tampa da caixa do filtro e despeje o extrato de carne restante para um copo estéril. Depois de 1 min de tempo de contato, passar a solução extrato de carne na carcaça junto com o restante no copo estéril lentamente através do filtro usando um recipiente de pressão ou bomba peristáltica. Recolhe-se o eluato numa proveta de vidro de 2 L. segundo eluição Repita os passos 1.1 usando um adicional de 500 ml de extrato de carne bovina tamponada de 1,5%, Mas aumentar o tempo de contato no Passo 1.1.2 para 15 min. Adicionar o extracto de carne a partir da segunda eluição, para o copo de 2 L contendo que a partir da primeira eluição. Adicionar uma barra de agitação estéril para o copo. 2. A f loculação orgânico Processo Concentração Esterilizar um eléctrodo de pH do tipo combinação com 0,525% de hipoclorito de sódio durante pelo menos 5 min. Lave o eletrodo com estéril dH 2 O e, em seguida, elimine o cloro com tiosulfato de sódio 0,05 M. Calibrar o medidor de pH usando pH 4 e 7 padrões. Colocar a proveta contendo o eluato sobre uma placa de agitação. Ligue a placa e aumentar a velocidade de agitação até um vórtice é formado. Ajustar o pH do eluato para 3,5 ± 0,1 lentamente por adição gota a gota de HCl 1,2 M para o eluato. Adicione o HCl gota a gota por causa disso rápida vai inactivar vírus. Durante este tempo o produto de eluição irá tornar-se turva como um precipitado começa a formar. Reduzir o spe misturandoed a uma agitação lenta e, em seguida, continuar a monitorar e manter o pH do eluato em 3,5 ± 0,1 à temperatura ambiente durante 30 min. Verter a suspensão de extracto de carne precipitado em um ou mais frascos de centrífuga e centrifuga-se durante 15 min a 2500 xg, a 4 ° C. Retirar os frascos de centrífuga e quer aspirado lentamente ou decanta-se o sobrenadante para evitar a perda do precipitado sedimentado. Descartar o sobrenadante. NOTA: Não pode haver uma variação considerável entre extrato de carne lotes na quantidade e qualidade do precipitado. O precipitado produzido a partir de alguns lotes irá dissolver-se rapidamente, enquanto que a partir de outros lotes dissolve-se com dificuldade. Adicionar 30 ml de fosfato de sódio 0,15 M para o frasco de centrífuga contendo o precipitado. Use fosfato de sódio 0,15 M, pH 9,0 para precipitados a partir de extrato lotes de carne que se dissolvem dentro de 5 min. Agita-se durante 10 min após o precipitado se dissolva completamente, e, em seguida, ir imediatamente para a etapa 2.7. Use fosfato de sódio 0,15 M, pH 7,0-7,5 para todos os outros precipitados. Agita-se durante 10-15 minutos para dissolver, ou de precipitados mais difíceis, dividi-las com uma espátula esterilizada, pelo desenho repetidamente a solução para cima e para baixo durante a agitação com uma pipeta, por agitação o precipitado a 160 rpm num agitador orbital, ou por uma combinação destes procedimentos. NOTA: Quando utilizar mais do que um frasco de centrífuga, combine os precipitados usando menos de 30 ml de fosfato de sódio e, em seguida, utilizar a parcela remanescente dos 30 ml para enxaguar as garrafas depois de combinar os precipitados em uma garrafa ou copo. Se o precipitado é combinada num frasco de centrífuga de fundo plano, adicionar uma barra de agitação ao frasco. Vá para a etapa 2.6.5. Se o precipitado é combinada numa garrafa de centrifugação com um fundo cónico, transferi-lo para uma pequena proveta de vidro e adicionar uma barra de agitação para o copo. Coloque a garrafa ou copo sobre um agitador magnético, e mexa até que o precipitate se dissolveu completamente. Re-esterilizar um eléctrodo de pH do tipo combinação com 0,525% de hipoclorito de sódio e dechlorinate com tiossulfato de sódio 0,05 M, como descrito no passo 2.1. Calibrar o medidor de pH usando pH 7 e 10 padrões. Lentamente, ajustar o pH do precipitado completamente dissolvido a 9,0 com NaOH 1 M e, em seguida, agita-se durante 10 min. Retirar a vareta de agitação e centrifugar o precipitado dissolvido durante 10 min a 4,000-10,000 xg e 4 ° C. Verter cuidadosamente o sobrenadante para um copo de vidro sem perturbar o sedimento. Adicionar uma barra de agitação no copo e descartar o pellet. Colocar a proveta sobre um agitador magnético, e agitar a solução. Adicionar 1,2 M HCl gota a gota, para ajustar o pH a 7,0-7,5. Filtrar esterilizar o sobrenadante por passagem através de um filtro esterilizante contendo um pré-filtro que tenha sido pré-tratado com 15 ml de extracto de carne 1,5%, 0,05 M de glicina, pH 7,0-7,5. Volum Amostra de Ensaioe (S) cálculos: Use a Equação 1 para calcular S para todas as amostras de teste excepto as Lab Fortificado em branco e Reagente de laboratório em branco, equação 1 em que D (volume da amostra original de água Analisada) é de 500 L para as águas subterrâneas, TSV (Total Volume de amostra) é o volume da amostra de campo passada através do filtro de cartucho electropositiva 5 polegadas recebido no laboratório, e FCSV (Final concentrado de volume de amostra) é o volume seguinte filtração no Passo 2,10. Um exemplo é mostrado na suplementar materiais Seção S4.1. Calcular S para o laboratório Fortificado branco (LFB, isto é, um controlo de qualidade positiva usando água de grau reagente sem sementes) e Reagente de laboratório em branco (LRB; isto é, um controlo de qualidade de reagente negativo utilizando água grau de pureza), multiplicando o FCSV por 0,3. Divida o FCSV em three sub-amostras. Prepare subamostras 1 e 2 com um volume igual a 1,04 vezes o volume da amostra de ensaio. Congelar esses sub-amostras a ou abaixo de -70 ° C, se eles não podem ser analisados ​​utilizando o ensaio total de vírus cultiváveis ​​(Subamostra 1, Passo 4) ou transformadas para os ensaios moleculares (não mostrados) dentro de 24 h; de outro modo, manter a 4 ° C. Congelar o volume restante (subamostra 3) igual ou inferior a -70 ° C. Calcule o inóculo Volume dividindo o S por 10. 3. total cultivável Virus Quantal Assay NOTA: Para todas as etapas sempre adicionar soluções com cuidado para evitar perturbar a monocamada de células. Decantar ou mídia aspirado de recipientes de ensaio contendo uma monocamada de células BGM em 3-6 dias após a divisão e, em seguida, adicionar um volume de solução de sal equilibrada igual aos meios de comunicação removidos. Decantar ou aspirar a solução de sal equilibrada do te de cultura celularvasos st sendo usado e, em seguida, inocular os frascos de ensaio de cultura de células Inocular 10 recipientes de ensaio para cada amostra de teste com um volume de uma subamostra igual ao volume do inóculo, juntamente com os totais de vírus cultiváveis ​​controlos do ensaio quantal (materiais suplementares secção S2.4). Para o LFB ea Lab Fortificado matriz da amostra (LFSM, ou seja, amostra de matriz de água semeada), preparar 5-, 25- e 125 diluições utilizando subamostra 3 e fosfato de sódio 0,15 M, pH 7,0-7,5 como diluente. Um exemplo de um procedimento para fazer as diluições é dada na secção suplementar materiais S3. Inocular 10 recipientes de ensaio de cultura de células foram lavadas para cada série de diluições usando um volume de inoculo em cada recipiente de ensaio, para além dos vasos inoculados com uma subamostra não diluída no passo 3.2.1. Para qualquer amostra de teste a partir do passo 3.2.1 (excepto os que foram inoculados no passo 3.2.2) que tem CPE em todas as 10 repetições depois de 14 dias de incubação (ver Passo 3.3), prépare diluições 5-, 25- e 125-, e 625-fold de subamostra 3. Inocular 10 lavada recipientes de ensaio de cultura de células para cada série de diluições utilizando um volume de inóculo em cada recipiente de ensaio, juntamente com um novo conjunto do total quântica vírus cultiváveis controles de análise (materiais suplementares seção S2.4). Distribuir o inoculo sobre a superfície das monocamadas de células por inclinação dos vasos e para trás. Incubar os recipientes de ensaio à temperatura ambiente durante 80-120 minutos numa plataforma de agitação mecânica a 1-5 oscilações / min ou com balanço dos vasos a cada 15-20 min para permitir qualquer vírus presente para adsorver às células. Adicionar meio de manutenção pré-aquecido, e então incubar os recipientes de ensaio a 36,5 ± 1 ° C. Olhe para o aparecimento do CPE em cada recipiente de ensaio usando um microscópio por dia durante a primeira 3 d e examiná-las a cada 2-3 dias até ao dia 14. Transferência de quaisquer recipientes de ensaio que mostram ≥75% CPE para um congelador fixado em ouabaixo de -70 ° C. Congelar todas as culturas remanescentes e os totais de vírus cultiváveis ​​controles de análise quântica igual ou inferior a -70 ° C depois de examinar os vasos no último dia. Descongelar todas as culturas e realizar uma filtragem ≥15% do meio a partir de cada recipiente de ensaio de CPE-positiva através de um filtro de esterilização de 0,2? M. Se o volume especificado não pode ser passada através do filtro devido ao entupimento, centrifugar o meio durante 10 minutos a 1,500-18,000 xg e 4 ° C antes da filtração. Executar uma segunda passagem de todos os recipientes de ensaio passagem 1ª usando recipientes de ensaio BGM lavadas. Inocular os novos recipientes de ensaio com um volume de inoculação que representa 10% do meio descongeladas a partir de todos os recipientes de ensaio e negativos a partir do meio filtrado a partir de vasos positivos. Repita os passos 3.2.4-3.4.3, mas congelar qualquer recipiente de ensaio que era negativa na passagem 1 e r positivo no dia 2, como descrito na etapa 3.3. Execute um passe 3ºidade, tal como descrito para a passagem 2 ND utilizando apenas os controlos do ensaio negativos e culturas de células que foram negativas durante a r uma passagem positiva e na passagem 2 nd. Identificar recipientes de ensaio individuais como positiva vírus quando eles mostram CPE, tanto no 1º e 2 passagens nd ou, no caso em que o CPE não ocorre até a passagem 2º, em ambos os trechos 2 º e 3 º. Use calculadora do Número Mais Provável USEPA com as configurações padrão do programa definidos como mostrado na Tabela S2 para calcular os títulos de vírus de todas as amostras de teste. Introduza o número de recipientes de ensaio replicar positivos do vírus da Etapa 3.6 para cada amostra de ensaio para a calculadora para determinar o valor / ml MPN (M mL) e superior (CL UML) e (CL LML) 95% dos limites de confiança / valores mais baixos ml . Obtain o valor NMP / L (M L) da amostra de ensaio correspondente, utilizando a equação 2. equação 2 M mL é o valor / ml MPN no Passo 3.7, S é o volume da amostra de ensaio, e D é o volume da amostra de água original ensaiadas. Calcule o superior confiança limite / L, substituindo o valor CL UML para o valor M mL. Calcule a menor confiança limite / L, substituindo o valor CL LML para o valor M mL. Um cálculo de exemplo é mostrado na suplementação de materiais Seção S4.2. Valores relatório M ml de 0, quando ≤ 1 / D. Por exemplo, ≤ 0,002 NMP / L (≤ 1/500 L) para as amostras de água subterrânea. Calcule os valores-limite de confiança MPN e 95% para cada Lab fortificada em branco e Lab Reagente de vazio por primeira multiplicando os valores / ml obtidos na calculadora S e, em seguida, dividindo o resultado por 0,3.