エンテロウイルスと文化とRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615計測。 II。総培養可能なウイルスアッセイ

注：定義のリストのための補足的な材料セクションS1を参照してください。 USEPAメソッド1615に関連したQA手順は補足材料セクションS2に記載されています。 1.フィルター溶出手順最初の溶出バッファリング1.5％牛肉エキス、pHが9.0の500ミリリットルを置き、メスシリンダー中で室温まで温めました。フィルターカートリッジハウジングを開き、完全に電気陽性フィルターをカバーするために牛肉エキスの十分な量を追加します。フィルターハウジング蓋を交換し、滅菌したビーカーに残った牛肉エキスを注ぎます。 接触時間の1分後、その圧力容器または蠕動ポンプを使用して、ゆっくりとフィルターを通して滅菌ビーカーに残っているとともに、ハウジング内の牛肉抽出液を通過させます。 2Lのガラスビーカーに溶出液を収集します。 2回目の溶出バッファリング1.5％牛肉エキスの追加の500ミリリットルを使用して、手順1.1を繰り返しますしかし、15分にステップ1.1.2での接触時間を増加させます。 2回目の溶出からの最初の溶出​​からそれを含む2リットルのビーカーに牛肉エキスを追加します。ビーカーに滅菌攪拌棒を追加します。 2.有機凝集濃度の手順少なくとも5分間、0.525％の次亜塩素酸ナトリウムとの組み合わせ型pH電極を滅菌します。無菌の dH 2 Oを有する電極をすすぎ、その後、0.05 Mチオ硫酸ナトリウムで脱塩素。 pHが4と7標準を使用してpH計を校正。 撹拌プレート上で溶出液を入れたビーカーを置きます。プレートをオンにして、渦が形成されるまで攪拌速度を上げます。 溶出液に1.2 M HClを滴下することにより、ゆっくりと3.5±0.1に溶出液のpHを調整します。急速な添加は、ウイルスを不活性化するため、塩酸滴下を追加します。沈殿物が形成し始めるようこの間の溶出液が白濁します。 混合SPEを削減ゆっくりと攪拌に編し、その後30分間、室温で3.5±0.1で溶出液のpHを監視し、維持し続けます。 4℃で2500×gで15分間一つ以上の遠心ボトルや遠心分離機に沈殿した牛肉エキス懸濁液を注ぎます。遠心機からボトルを取り出して、いずれかの吸引またはゆっくりペレット状の沈殿物の損失を防ぐために、上清をデカントします。上清を捨てます。 注：沈殿物の量と質で牛肉エキスのロット間のかなりの変動がある場合もあります。他のロットからそれが困難で溶解しながら、いくつかのロットから生成した沈殿物を迅速に溶解します。 沈殿物を含む遠心ボトルに、0.15Mリン酸ナトリウムの30ミリリットルを追加します。 0.15 Mリン酸ナトリウム、5分以内に溶解牛肉​​エキスロットからの沈殿物のためのpH 9.0を使用してください。沈殿物が完全に溶解した後、10分間攪拌し、その後、2.7のステップにすぐ進みます。 他のすべての沈殿物のために0.15 Mリン酸ナトリウム、pHが7.0から7.5を使用してください。 、またはより困難な沈殿物のために溶解するために10〜15分間攪拌し、オービタルシェーカー上で160 rpmで沈殿物を振盪することにより、ピペットで攪拌中に繰り返し上下ソリューションを描くことによって、滅菌スパチュラでそれらを破ります、またはこれらの手順の組み合わせによって。 注：複数の遠心分離ボトルを使用して、リン酸ナトリウム未満の30ミリリットルを使用して沈殿物を結合した​​後、1瓶やビーカーに沈殿物を合成後のボトルをすすぐために30ミリリットルの残りの部分を使用します。 合わせた沈殿物を平底遠心分離ボトル内にある場合、瓶に攪拌棒を加えます。 2.6.5に進みます。 合わせた沈殿物が円錐形の底部を有する遠心分離ボトル内にある場合は、小さなガラスビーカーにそれを転送し、ビーカーにスターラーバーを追加します。 マグネチックスターラー上に瓶やビーカーを置き、PRまで攪拌ecipitateは完全に溶解しました。 0.525％の次亜塩素酸ナトリウムとの組み合わせ型pH電極を再滅菌し、工程2.1に記載のように0.05 Mチオ硫酸ナトリウムを用いて脱塩素。 pHは7と10の規格を使用してpH計を校正。ゆっくりと、1M NaOHで9.0に完全に溶解させ、沈殿物のpHを調整した後、10分間攪拌します。 攪拌棒を外し、4,000-10,000×gで、4℃で10分間溶解した沈殿物を遠心分離します。 ペレットを乱さないように注意しガラスビーカーに上清を注ぎます。ビーカーに攪拌棒を追加し、ペレットを捨てます。 マグネチックスターラー上にビーカーを置き、溶液をかき混ぜます。 7.0から7.5にpHを調整するのが賢明1.2 M HClのドロップを追加します。 フィルターは、1.5％牛肉エキスの15ミリリットル、0.05 Mグリシン、pHが7.0〜7.5で前処理されたプレフィルターを含む滅菌フィルターを通過させることにより、上清を滅菌します。 アッセイサンプルVolumE（S）の計算。 空白空白ラボ要塞を除くすべての試験サンプルおよびラボ試薬のためにSを計算するために使用する式（1）、 式（1） D（アッセイしたオリジナル水試料の体積）は、地下水の500 Lであり、TSV（総サンプル量）は、フィールドサンプルの量は、実験室で受信された5インチ陽電カートリッジフィルター、およびFCSV（最終濃縮サンプルボリューム）を通過させますステップ2.10でろ過以下の体積です。例では、補足的な材料セクションS4.1に示されています。 そしてブランクラボ試薬（LRB、 すなわち 、試薬グレードの水を使用して、負の品質管理）0.3によってFCSVを乗じて、ブランクラボ要塞（ すなわち 、シードされた試薬グレードの水を使用して、正の品質管理LFB）のためにSを計算します。 THREにFCSVを分割Eのサブサンプル。 1.04倍アッセイサンプル量と同量のサブサンプル1と2を準備します。彼らは、全培養可能なウイルスアッセイ（サブサンプル1、ステップ4）を用いて分析または24時間内の分子アッセイ（図示せず）のために処理することができない場合は-70℃以下にこれらのサブサンプルを凍結します。それ以外の場合は、4℃で保持します。 で、または-70℃以下に残りの容量（サブサンプル3）をフリーズします。 10でSを分割することにより種菌の体積を計算します 。 3.総培養可能なウイルス素量アッセイ注：すべての手順については、常に細胞単層を乱さないように注意してくださいソリューションを追加します。 デカントまたは3-6日後に分割でBGM細胞の単層を含む試験容器から吸引メディアとその後除去メディアに等しい平衡塩溶液の量を追加します。 細胞培養TEからバランスのとれた塩溶液をデカントまたは吸引目の容器を使用し、次いで、細胞培養試験容器に接種されました （補足材料セクションS2.4）総培養可能なウイルス量子アッセイ対照と一緒に接種物の容積に等しいサブサンプル1の体積で各試験サンプルのための10試験容器を接種します。 LFBとラボ強化さサンプルマトリックス（LFSM; すなわち 、播種水マトリックスサンプル）の場合は、希釈剤としてサブサンプル3および0.15 Mリン酸ナトリウム、pHが7.0から7.5を使用して5-、25-、および125倍希釈液を準備します。希釈液を作製するための手順の一例を補足材料セクションS3に示されています。ステップ3.2.1で希釈していないサブサンプル1を接種した血管に加えて、各試験容器に接種物のボリュームを使用して、各希釈系列のための10洗浄した細胞培養試験容器を接種します。 インキュベーションの14日後、すべての10連でCPEを持っている（ステップ3.2.2に接種したもの以外の）ステップ3.2.1から任意の試験サンプルについては、事前に（ステップ3.3を参照してください）5-、25-、および125-を削減する、とサブサンプル3の625倍希釈液を接種10は、全培養可能なウイルス量子の新しいセットと一緒に各試験容器に接種物のボリュームを使用して、各希釈系列のための細胞培養試験容器を洗浄しアッセイ対照（補足材料セクションS2.4）。 前後に血管を傾けることによって、細胞単層の表面上に接種物を配布します。存在する任意のウイルスを細胞に吸着することができるように、すべての15-20分1-5振動/分で、または血管の揺り動かしながら機械的ロッキングプラットフォーム上で80-120分間室温で試験容器をインキュベートします。 予め温め維持培地を追加し、36.5±1℃で試験容器をインキュベートします。 最初の3日間、毎日顕微鏡を用いて、各試験容器内のCPEの出現を探し、その後、またはに設定冷凍庫に≥75％のCPEを示す日までの14転送任意の試験容器2〜3日ごとにそれらを調べます以下-70℃です。最終日に血管を調べた後-70℃以下に残りのすべての文化や総培養可能なウイルス量子アッセイ対照をフリーズします。 すべての文化を解凍し、0.2μmの滅菌フィルターを通してすべてのCPE陽性試験容器からの媒体の≥15％をフィルタリングします。指定されたボリュームが目詰まりにフィルタを通過することができない場合は、濾過前に1,500-18,000×gで4℃で10分間、培地を遠心します。 洗浄BGMの試験容器を使用して、すべての第1通路試験容器の第2の通路を実行します。 すべての負の試験容器から、正の血管から濾過さ媒体から解凍した培地の10％を表し接種量で新しい試験容器を接種します。 ステップ3.2.4-3.4.3を繰り返しますが、ステップ3.3で説明したように2 回目に1 回目の通路上の負及び正だった任意の試験容器を凍結します。 3 番目のパスを実行唯一のマイナスアッセイ対照と第2通路内の 1 回目の通過時に負と陽性であった細胞培養物を使用して、2 回目の通過のために説明したように年齢。 彼らは1 番目と2 番目の通路の両方でCPEまたは、CPEは、第2および第3の通路の両方で、2 番目の通路まで発生していない場合はを表示したときに、ウイルス陽性と個々の試験容器を特定します。 すべての試験サンプルのウイルス力価を計算するために、 表S2に示すように設定されたデフォルトのプログラム設定でUSEPAの最確数の電卓を使用します。 入力MPN / mlの値（M mL）および上部（CL UML）と下位（CL 1mLの ）95％信頼限界/ mlの値を決定する計算に各試験サンプルのためのステップ3.6からのウイルス陽性の複製試験容器の数。 O式2を使用して対応する試験サンプルのMPN / L値（Mの L）btain。 式（2） M mLのステップ 3.7でMPN / mlの値であり、Sは、 分析試料の体積であり、そしてDは、 アッセイ され た元の水試料の体積です。 M mLの値のCL UML値を代入することにより、上側信頼限界/ Lを計算します。 M mLの値のCL 1mLの値を代入することにより信頼下限/ Lを計算します。計算例は補足材料セクションS4.2に示されています。 0 / D 1≤などの報告M mLの値。例えば、地下水試料の0.002 MPN / L（≤1/500 L）≤。 MPNとブランク要塞各ラボの95％信頼限界値とラボのReを計算します第1のSにより計算で得られた値/ mlに乗算した後、0.3によって、結果を分割することによってブランクエージェント。