מדידת שיטת EPA 1615. של enterovirus ואת מופע norovirus במים על ידי תרבות RT-qPCR. II. Assay וירוס culturable סה"כ
Summary
Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.
Abstract
A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency’s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.
Introduction
וירוסים מעיים הם קבוצה מגוונת של וירוסים המדביקים מערכת העיכול האנושית ואשר מועברים באמצעות מחזור צואה-פה. וירוסים אלה להיכנס למים משטח הקרקע באמצעות מכון טיהור שפכים וקולחין בור ספיגה, בורות שופכין תוכנן או שבורה כהלכה, קווי ביוב שבורים, גלישות הביוב בשילוב, ומקורות נקודת והלא נקודה אחרת 1-4. זיהומים ומחלות אדם מפני וירוסי waterborne להתרחש באמצעות צריכת מים מזוהמים או לחטא כראוי או באמצעות מגע מים ופנאי. תסמיני המחלה עשויה להיות כרוכה קלה עד גסטרואנטריטיס חמור; דַלֶקֶת הַלַחמִית; קַדַחַת; מצוקת נשימת עליונות; מחלת הפה, הידיים והרגליים; דַלֶקֶת שְׁרִיר הַלֵב; דלקת קרום המוח; דַלֶקֶת הַמוֹחַ; שיתוק; אלח דם 5-8, ומוות 9,10.
USEPA שיטה 1615 מספקת הליך למדוד חלקיקי נגיף מעיים זיהומיות במי סביבה ושתייה. מים אלה יכולים להכילתערובת של virions זיהומיות שאינם מדבק, אלא רק את חלקיקי זיהומיות להוות סיכון בריאותי פוטנציאלי. חלקיקי הנגיף מדבק לאבד infectivity לאורך זמן במים הסביבה ושתייה מאיבוד שלמות קפסיד חלבון, נזק חומצות גרעין בשל קרינת UV מפני השמש, ונזק עקב כל חומרי חיטוי שעשויים להיות נוכחים 11-13. הליך הווירוס culturable הכולל שנקבע השיטה מבוסס על הייצור של תופעות cytopathic (CPE) בכליות הקוף באפלו גרין (BGM) שורת התאים. שורת תא זו נבחרה בגלל השימוש הנרחב שלה בתחום וירולוגיה הסביבתי 14,15, למרות מגוון סוגי וירוס מדבקים שיאותרו מוגבלים בעיקר enteroviruses מסוים 15. מטרת מאמר זה היא לתאר לנהלי שיטת 1615 עבור elution של מסנני מחסנית electropositive חמש אינץ ', ריכוז משני, ומדידה של וירוסי culturable הכולל. הערכה שלשיטה הכוללת מתוארת Cashdollar et al. 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
USEPA שיטת 1615 פותחה לשימוש במהלך מחזור הניטור השלישי של תקנת הניטור המזהמת ללא פיקוח (UCMR3) 17 ו מיועדת בעיקר למדידת התרחשות וירוס במי תהום. היא חולקת מספר צעדים משותפים עם כלל איסוף מידע (ICR) השיטה, 15,18 אבל יש שני הבדלים קלים. שניהם להשתמש מבחני quantal למדוד וירוס מייצרי CPE על משטחי תא BGM עם quantitation בהיותה מבוססת על חישובים רוב מספר Probable (MPN). השיטה 1615 מאפשרת השימוש במסנן electropositive חדש לריכוז מוירוס מטריצות מים שונים מפחיתה את מספר כלי בדיקת תרבית תאים משכפל לכל דילול מ -20 עד 10. שניהם שינויים קלים להפחית עלויות שיטה כוללות. הירידה במספר משכפל מפחית עבודה, אבל התוצאה היא גבול הגילוי נמוך במקצת. למרות groundwaters צפוי להיות בעלי ריכוזים נמוכים של וירוסים מאשר מים עיליים, 19,20 הכמות מדגם E assayed גבוה פי חמישה מריכוז של מים עיליים, פיצוי בין השאר על ההבדלים. השימוש משכפל יהיה פחות נאות עבור המים העיליים ביותר, אבל כמה ידרשו דילול מדגם.
יש שיטה 1615 מספר צעדים ומגבלות קריטיים. תמציות בשר להשתנות ממגרש למגרש. כל הרבה צריך ייבדקו אפקטיבי של elution הווירוס ואת יכולת ריכוז וירוס לאורך שלבי ריכוז משני כמתואר הוא S2.3 סעיף וחומרים משלימים. השיטה משתמשת בנוסחאות מדויקות לחישוב כמות מדגם לחסן על תרביות תאים BGM ולקבוע titers וירוס. תוצאות לא מדויקות תופקנה אם נוסחות אלה אינן אחריו בקפדנות. טכניקת aseptic פרופר חייבת לשמש לשמירה על תרביות תאים. שולט נגוע תרבית תאי BGM המראים מצוקה במהלך תקופת דגירת 14 היום להצביע על בעיות סבירות עם תחזוקת תרבית תאים. בזהירות רבה גם חייבת להיות taקן במהלך pipetting השלבים הכרוכים עם חיסון של והוספת בינוני עד צלוחיות תרבית תאים, כדי למנוע זיהום צולב. פקדי האיכות המתוארים S2 סעיף חומרי משלים חייבים להיות מלווה בקפדנות. סעיף S2 גם מספק ייעוץ לפתרון בעיות איכות.
המנגנון העיקרי של ספיחת נגיף electropositive מסנן אינטראקצית תשלום הקשורים לחוזק של המטען החיובי על המסנן ואת הכח של המטען השלילי "הווירוס הקשורים חודה איזואלקטרית ואת ה- pH של המים נבדקים 21. Elution ממסנני מושפע גם את עוצמת האינטראקציות הללו. כי הם משתנים בין סוגי וירוס ואפילו בין זנים בתוך אותו הסוג, elution מהמסננים אינו אחיד. משמעות הדבר היא כי כל תוצאה שעלולה להמעיט בהערכת רמת בפועל של וירוס נוכחי במי סביבה. השימוש של הקו הסלולרי BGM היחיד גם מזלזל התרחשות וירוס. הטווחשל וירוס מעיים שיכולים לייצר CPE בתור תא זה בעיקר מוגבל polioviruses ו קפסיד מינים enterovirus B, כמו גם כמה reoviruses 14,15,22. סוגי וירוס מדבק אחרים לא יזוהו.
החלמת poliovirus ממי קרקע כיתה המגיבה עמדה בקריטריונים לקבלת ביצועי USEPA שיטת 1615 הן הערכת הביצועים (PE; כלומר, דגימות מי כיתה מגיבה זורעת עם טיטר הידוע אנליסט המשמשים כדי להעריך את הביצועים של המטפל לפני התחילה מחקר) ודגימות LFB (S1 טבלת חומרים משלימים). התאוששות 58% ממי תהום באמצעות הליך התרבות דומה לזו שדווחה על ידי אחר באמצעות ברז מים 23,24. ההתאוששות הממוצעת מתחיילת דגימות LFB של 111% עם מקדם שונה (CV) של 100% גם פגשה את הקריטריונים לקבלת ביצועי שיטה למרות שהם גבוהים מזה שנצפה עבור דגימות PE during ICR. ICR מתכוון התאוששות מעבדתיות הייתה 56% עם מקדם השונה (CV) של 92% תוך החלמת intralaboratory ממוצע נעה בין 36 ל -85% (קו"ח 58 כדי 131%; נתונים שלא פורסמו ממסד נתוני PE ICR). החלמה גבוהה נצפתה במחקר זה עבור דגימות נמוכות זרע LFB מאשר דגימות זרע גבוהות יותר (122 לעומת 42%). בזמנו כי ICR היה מתוכנן, זה היה צפוי כי דגימות PE קבלת ערכי זרע נמוכים תצטרכנה התאוששות נמוכה כי מקבלי זרעים גבוהים. דומה לזה שנצפה כאן עבור דגימות LFB, התאוששות poliovirus עבור דגימות PE ICR היו 71% (CV 100%), 54% (CV 69%), ו -44% (CV 71%) עבור ערכים זרע ≤300 MPN, 300 1,500 MPN, ו> 1,500 MPN, בהתאמה.
ישנן שיטות רבות למדידת וירוס מדבק בדגימות מי 25. שיטה זו היא משמעותית ביחס לשיטות אחרות במידת סטנדרטיזציה. הסטנדרטיזציה לא רק כוללת בקרות איכות וביצועים,אלא גם משתמש כרכים ונוסחות מוגדרים על מנת להבטיח כי כל מעבדות האנליטיות לבצע את השיטה זהה. ללא סטנדרטיזציה, קשה להשוות את התוצאות על פני מעבדות, ולכן תקינה חיונית בעת ביצוע מחקרים רחבי היקף מעבדות אנליטיות מרובות. עם סטנדרטיזציה מובנית בשיטה זו ניתן להרחיב בעתיד לכלול סוגי וירוס נוספים שורות תאים. מחקר מתנהל כדי לספק נתונים עבור הכללת אדנו לתוך השיטה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, for supplying the Sabin poliovirus serotype 3 used in this study; Mary Jean See, Nancy Schable, and Jenifer Jones of Dynamac Corporation for preparation of BGM cultures; Nichole E. Brinkman, Shannon M. Griffin, Brian R. McMinn, Eric R. Rhodes, Eunice A. Varughese, Ann C. Grimm, Sandhya U. Parshionikar, and Larry Wymer for contributions in the overall evaluation of USEPA Method 1615; Gretchen Sullivan for technical assistance; and local private well owners and utilities for allowing us to collect water samples. Although this work was reviewed by USEPA and approved for publication, it may not necessarily reflect official Agency policy. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Beef extract, desiccated powder | BD Bacto | 211520 | |
| Cryogenic tubes | Thermo Fisher | 3775/945373 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | |
| Mechanical rocking platform | Daigger | EF4907G | |
| Orbital shaker | Thermo Fisher | 14-285-729 | |
| Sterilizing filter with prefilter | VWR | 28143-295 | |
| Sterilizing syringe filter | Corning | 431219 | |
| pH Standards | Sigma-Aldrich | 33643, 33646, 33648 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M1018 or M4642 | |
| Leibovitz L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | |
| Sodium bicarbonate, 7.5% | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-139 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Trypsin, EDTA | Invitrogen | 25200072 |
References
- Bradbury, K. R., et al. Source and transport of human enteric viruses in deep municipal water supply wells. Environ. Sci. Technol. 47 (9), 4096-4103 (2013).
- Aslan, A., Xagoraraki, I., Simmons, F. J., Rose, J. B., Dorevitch, S. Occurrence of adenovirus and other enteric viruses in limited-contact freshwater recreational areas and bathing waters. J. Appl. Microbiol. 111 (5), 1250-1261 (2011).
- Begier, E. M., et al. An outbreak of concurrent echovirus 30 and coxsackievirus A1 infections associated with sea swimming among a group of travelers to Mexico. Clin. Infect. Dis. 47 (5), 616-623 (2008).
- Anderson, A. D., et al. A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001. J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).
- Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. Norovirus gastroenteritis. N.Engl.J. Med. 361 (18), 1776-1785 (2009).
- Khetsuriani, N., Lamonte-Fowlkes, A., Oberst, S., Pallansch, M. A. Enterovirus surveillance–United States. MMWR Surveill. Summ. 55 (8), 1-20 (2006).
- Sawyer, M. H. Enterovirus infections: diagnosis and treatment. Semin. Pediatr. Infect. Dis. 13 (1), 40-47 (2002).
- Abzug, M. J., Finn, A., Pollard, A. J. The enteroviruses: an emerging infectious disease? The real, the speculative and the really speculative. Hot Topics in Infection and Immunity in Children. , (2008).
- Harris, J. P., Edmunds, W. J., Pebody, R., Brown, D. W., Lopman, B. A. Deaths from norovirus among the elderly, England and Wales. Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1546-1552 (2008).
- Ho, M., et al. An Epidemic of Enterovirus 71 Infection in Taiwan. New England J. Med. 341 (13), 929-935 (1999).
- Bae, J., Schwab, K. J. Evaluation of murine norovirus, feline calicivirus, poliovirus, and MS2 as surrogates for human norovirus in a model of viral persistence in surface water and groundwater. Appl. Environ. Microbiol. 74 (2), 477-484 (2008).
- Ward, R. L., Knowlton, D. R., Winston, P. E. Mechanism of inactivation of enteric viruses in fresh water. Appl. Environ. Microbiol. 52 (3), 450-459 (1986).
- Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Effects of Source Water Quality on Chlorine Inactivation of Adenovirus, Coxsackievirus, Echovirus, and Murine Norovirus. Appl. Environ. Microbiol. 76 (15), 5159-5164 (2010).
- Dahling, D. R., Wright, B. A. Optimization of the BGM cell line culture and viral assay procedures for monitoring viruses in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 51 (4), 790-812 (1986).
- Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W., Dahling, D. R., Stetler, R. E. EPA/600/R-95/178. ICR Microbial Laboratory Manual. , (1996).
- Cashdollar, J. L., et al. Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water. Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).
- USEPA. 40 CFR Parts 141 and 142 Revisions to the Unregulated Contaminant Monitoring Regulation (UCMR3) for Public Water Systems Final Rule. Federal Register. 77 (85), 26072-26101 (2012).
- USEPA. 40 CFR Part 141 National Primary Drinking Water Regulations: Monitoring Requirements for Public Drinking Water Supplies; Final Rule. Federal Register. 61 (94), 24353-24388 (1996).
- Shaw, S., Regli, S., Chen, J., McGuire, M. J., McLain, J. L., Obolensky, A. Virus occurrence and health risks in drinking water . Information Collection Rule Data Analysis. , 437-462 (2002).
- Lieberman, R. J., et al. . Microbial monitoring of vulnerable public groundwater supplies. , (2002).
- Lukasik, J., Scott, T. M., Andryshak, D., Farrah, S. R. Influence of salts on virus adsorption to microporous filters. Appl. Environ. Microbiol. 66 (7), 2914-2920 (2000).
- Sedmak, G., Bina, D., MacDonald, J. Assessment of an enterovirus sewage surveillance system by comparison of clinical isolates with sewage isolates from milwaukee, wisconsin, collected august 1994. Appl. Environ. Microbiol. 69 (12), 7181-7187 (2003).
- Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water. Appl. Environ. Microbiol. 77 (10), 3500-3506 (2011).
- Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. J Appl Microbiol. 115 (1), 1-11 (2013).
