Méthode EPA 1615. Mesure des entérovirus et Norovirus Présence dans l'eau par la culture et de RT-qPCR. II. Total des cultivable Virus Assay

NOTE: S'il vous plaît voir la section des matériaux supplémentaires S1 pour une liste de définitions. Les procédures d'AQ associés à USEPA Method 1615 sont décrites dans le matériel supplémentaire section S2. 1. Filtre procédure Elution On élue d'abord Placer 500 ml de tampon extrait de bœuf 1,5%, pH 9,0, chauffée à la température ambiante dans un cylindre gradué. Ouvrez le filtre cartouche de logement et ajouter une quantité suffisante d'extrait de boeuf pour couvrir le filtre electropositive complètement. Remettre le couvercle du boîtier de filtre et versez l'extrait de boeuf restant dans un bêcher stérile. Après 1 min de temps de contact, passer la solution d'extrait de boeuf dans le boîtier ainsi que restant dans le bécher stérile lentement à travers le filtre à l'aide d'un récipient sous pression ou d'une pompe péristaltique. Recueillir l'éluat dans un 2 L bêcher en verre. Deuxième élution Répétez les étapes 1.1 en utilisant un supplément de 500 ml de tampon de 1,5% d'extrait de boeuf, Mais augmenter le temps de contact à l'étape 1.1.2 à 15 min. Ajouter l'extrait de boeuf de la seconde élution dans le bécher de 2 L contenant que de la première élution. Ajouter une barre d'agitation stérile dans le bécher. 2. floculation organique Concentration Procédure Stériliser une électrode de pH de type combinaison avec l'hypochlorite de sodium à 0,525% pendant au moins 5 min. Rincer l'électrode avec stérile dH 2 O puis déchlorer avec 0,05 M de thiosulfate de sodium. Calibrer le pH-mètre en utilisant un pH de 4 et 7 normes. Placer le bécher contenant l'éluat sur une plaque d'agitation. Tournez sur la plaque et augmenter la vitesse d'agitation jusqu'à ce qu'un vortex est formé. Ajuster le pH de l'éluat à 3,5 ± 0,1 par lente addition goutte à goutte de HCl 1,2 à l'éluat. Ajouter HCl goutte à goutte, car plus rapide sera inactiver le virus. Pendant ce temps, l'éluat devient trouble sous forme de précipité commence à se former. Réduire le spe mélangeed à une agitation lente et puis continuer à surveiller et maintenir le pH de l'éluat à 3,5 ± 0,1 à la température ambiante pendant 30 min. Versez l'extrait de boeuf suspension précipitée dans une ou plusieurs bouteilles de centrifugeuse et centrifuger pendant 15 min à 2500 xg à 4 ° C. Retirer les bouteilles de la centrifugeuse et, soit aspirer ou décanter le surnageant lentement pour éviter la perte du précipité granulée. Jeter le surnageant. NOTE: Il peut y avoir des variations considérables entre les lots d'extrait de boeuf dans la quantité et la qualité du précipité. Le précipité produit à partir de certains lots se dissoudra rapidement tandis que celle d'autres beaucoup dissout avec difficulté. Ajouter 30 ml de phosphate de sodium 0,15 M à la bouteille centrifugeuse contenant le précipité. Utilisez le phosphate de sodium 0,15 M, pH 9,0 pour précipités de boeuf extrait beaucoup qui se dissolvent dans les 5 min. Agiter pendant 10 minutes après le précipité est complètement dissous, puis passez immédiatement à l'étape 2.7. Utiliser le phosphate de sodium 0,15 M, pH 7,0 à 7,5 pour toutes les autres précipités. Agiter pendant 10-15 min pour dissoudre, ou précipités plus difficiles, les briser avec une spatule stérile, en tirant à plusieurs reprises la solution de haut en bas au cours de l'agitation avec une pipette, en secouant le précipité à 160 rpm sur un agitateur orbital, ou par une combinaison de ces procédures. NOTE: Lorsque vous utilisez plus d'une bouteille de centrifugeuse, combiner les précipités en utilisant moins de 30 ml de phosphate de sodium, puis utiliser la partie restante de 30 ml pour rincer les bouteilles après la combinaison des précipités dans une bouteille ou un bécher. Si le précipité combiné est dans un fond bouteille de centrifugeuse plat, ajouter une barre d'agitation à la bouteille. Passez à l'étape 2.6.5. Si le précipité combiné est dans une bouteille de centrifugeuse avec un fond conique, le transférer dans un petit récipient en verre et ajouter une barre d'agitation dans le bécher. Placez la bouteille ou bêcher sur un agitateur magnétique, et remuer jusqu'à ce que le precipitate a complètement dissous. Restériliser une électrode de pH du type à combinaison avec l'hypochlorite de sodium à 0,525%, et déchlorer avec du thiosulfate de sodium 0,05 M comme décrit dans l'étape 2.1. Calibrer le pH-mètre en utilisant un pH de 7 et 10 normes. Ajuster lentement le pH du précipité complètement dissous à 9,0 avec 1 M NaOH, puis on agite pendant 10 min. Retirez la barre d'agitation et centrifuger le précipité dissous pendant 10 min à 4000-10000 xg et 4 ° C. Versez délicatement le surnageant dans un récipient en verre sans perturber le culot. Ajouter une barre d'agitation dans le bécher et jeter le culot. Placer le bécher sur un agitateur magnétique, et agiter la solution. Ajouter 1,2 goutte HCl M sage d'ajuster le pH à 7,0-7,5. Filtre stérilise le surnageant par passage à travers un filtre de stérilisation contenant un pré-filtre, qui a été prétraitée avec 15 ml de 1,5% d'extrait de bœuf, 0,05 M de glycine, pH 7,0 à 7,5. Assay Volum Samplee (S) calculs: Utiliser l'équation 1 pour calculer S pour tous les échantillons d'essai, sauf le Lab Fortified Blank et le laboratoire Blanc réactif, L'équation 1 où D (Volume de l'échantillon d'origine de l'eau titré) est de 500 L pour les eaux souterraines, TSV (Total Volume d'échantillon) est le volume de l'échantillon de terrain passé à travers le filtre à cartouche electropositive 5 pouces reçu par le laboratoire, et FCSV (Final concentré Volume échantillon) est le volume après filtration à l'étape 2.10. Un exemple est présenté dans la section supplémentaire des matériaux S4.1. Calculer S pour le Lab Fortified Blank (LFB, à savoir, un contrôle de la qualité positive en utilisant l' eau de qualité réactif ensemencé) et le laboratoire Blanc réactif (LRB, à savoir, un contrôle de qualité négative en utilisant l' eau de qualité réactif) en multipliant le FCSV de 0,3. Diviser le FCSV en three. des sous-échantillons Préparer des sous – échantillons 1 et 2 avec un volume égal à 1,04 fois le volume de dosage d'échantillon. Congeler ces sous-échantillons au niveau ou en dessous de -70 ° C si elles ne peuvent pas être analysés en utilisant le test totale cultivable de virus (sous-échantillon 1, étape 4) ou traitées pour les tests moléculaires (non représentés) dans les 24 heures; autrement, maintenir à 4 ° C. Congeler le volume restant (sous-échantillon 3) égale ou inférieure à -70 ° C. Calculer le volume de l' inoculum en divisant le S par 10. 3. totale cultivable Virus Quantal Assay REMARQUE: Pour toutes les étapes ajoutent toujours des solutions avec soin pour éviter de perturber la monocouche cellulaire. Décanter ou supports de prélèvement à partir de récipients d'essai contenant une monocouche de cellules BGM à 3-6 jours après le fractionnement, puis ajouter un volume de solution saline équilibrée égale aux médias enlevés. Décanter ou aspirer la solution saline équilibrée de la te de culture cellulaireles navires st utilisés puis ensemencer les récipients d'essai de culture cellulaire Inoculer 10 récipients d'essai pour chaque échantillon d'essai avec un volume de sous – échantillon 1 égal au volume de l' inoculum ainsi que le total des virus cultivable quantiques contrôles de dosage (matériel supplémentaire section de S2.4). Pour le LFB et le Lab Fortifié matrice de l' échantillon (LFSM; ie, ensemencées échantillon de matrice d'eau), préparer 5-, 25-, et des dilutions de 125 fois en utilisant souséchantillon 3 et phosphate de sodium 0,15 M, pH 7,0-7,5 comme diluant. Un exemple d'un procédé pour la fabrication des dilutions en est donnée dans la section supplémentaire de matériaux S3. Inoculer 10 lavés culture cellulaire récipients d'essai pour chaque série de dilution à l' aide d' un volume inoculum sur chaque récipient d'essai en plus des navires inoculés avec sous – échantillon non dilué 1 à l' étape 3.2.1. Pour tout échantillon d'essai de l'étape 3.2.1 (autres que ceux inoculés à l'étape 3.2.2) qui a CPE dans tous les 10 répétitions après 14 jours d'incubation (voir l'étape 3.3), prépare dilutions 5-, 25-, et 125- et 625-fold de sous – échantillon 3. Inoculer 10 lavé culture cellulaire récipients d'essai pour chaque série de dilution à l' aide d' un volume inoculum sur chaque récipient d'essai avec un nouvel ensemble de la quantal totale du virus cultivable contrôles de dosage (matériel supplémentaire section de S2.4). Distribuer l'inoculum sur la surface des monocouches de cellules par l'inclinaison des récipients en arrière. Incuber les récipients d'essai à la température ambiante pendant 80 à 120 minutes sur une plate-forme à bascule mécanique à 1-5 oscillations / min ou à bascule des vaisseaux toutes les 15-20 minutes pour permettre à tout virus présent à adsorber aux cellules. Ajouter un milieu d'entretien préchauffée, puis incuber les récipients d'essai à 36,5 ± 1 ° C. Recherchez l'apparition de CPE dans chaque récipient d'essai à l'aide d'un microscope par jour pour les 3 premiers d, puis les examiner tous les 2-3 jours jusqu'au jour 14. Transfert des récipients d'essai qui montrent ≥75% CPE dans un congélateur ou fixé àen dessous de -70 ° C. Geler toutes les cultures restantes et le total des virus cultivable quantiques contrôles de dosage au niveau ou en dessous de -70 ° C après avoir examiné les navires le dernier jour. Décongeler toutes les cultures et filtrer ≥15% du milieu de chaque récipient d'essai CPE positif à travers un filtre de stérilisation de 0,2 um. Si le volume spécifié ne peut pas être passé à travers le filtre en raison de l'obstruction, centrifuger le milieu pendant 10 min à 1,500-18,000 xg et 4 ° C avant la filtration. Effectuer un second passage de tous les 1 er récipients d'essai de passage à l' aide de récipients d'essai BGM lavés. Inoculer les nouveaux récipients d'essai avec un volume d'inoculation qui représente 10% du milieu décongelé de tous les récipients d'essai négatifs et du milieu filtré à partir de navires positifs. Répétez les étapes 3.2.4-3.4.3, mais geler tout navire d'essai qui était négatif sur le 1 er passage et positif sur la 2 e comme décrit à l' étape 3.3. Effectuer une 3 ème passeâge comme décrit pour le 2 ème passage en utilisant uniquement les contrôles de dosage négatifs et des cultures cellulaires qui étaient négatifs au cours du 1 er passage et positif dans le 2 ème passage. Identifier les récipients d'essai individuels que le virus positif quand ils montrent CPE à la fois le 1 er et 2 ème passages ou, dans le cas où CPE ne se produit pas jusqu'à ce que le 2 ème passage, tant dans les 2 ème et 3 ème passages. Utilisez Calculatrice de nombre le plus probable de l' USEPA avec les paramètres par défaut du programme définis comme indiqué dans le tableau S2 pour calculer les titres de virus de tous les échantillons de test. Entrez le nombre de virus positifs récipients d'essai de répétition de l' étape 3.6 pour chaque échantillon d'essai dans la calculatrice pour déterminer la valeur / ml MPN (M ml) et la partie supérieure (CL Uml) et (CL LML) 95% limites de confiance / valeurs ml inférieures . Obtenir la / valeur L MPN (M L) de l'échantillon d'essai correspondant en utilisant l' équation 2. équation 2 M mL est la valeur / ml MPN à l' étape 3.7, S est le dosage Volume d'échantillon, et D est le volume de l' échantillon d'eau d' origine titré. Calculer la confiance limite supérieure / L en substituant la valeur CL Uml pour la valeur M mL. Calculer la limite inférieure de confiance / L en substituant la valeur CL LML pour la valeur M mL. Un exemple de calcul est indiquée dans la section complémentaire des matériaux S4.2. Rapport des valeurs M ml de 0 comme ≤ 1 / D. Par exemple, ≤ 0,002 NPP / L (≤ 1/500 L) pour les échantillons d'eau souterraine. Calculer les valeurs limites de confiance NPP et 95% pour chaque Lab Fortifié Blank et Lab ReAgent Blank en multipliant d' abord les valeurs / ml obtenues dans la calculatrice par S, puis en divisant le résultat par 0,3.