EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in Water per cultuur en RT-qPCR. II. Totaal kweekbare Virus Assay

OPMERKING: Zie aanvullende materialen sectie S1 voor een lijst met definities. De QA-procedures in verband met USEPA Method 1615 worden beschreven in de aanvullende materialen sectie S2. 1. Filter Elutie Procedure eerste Elutie Plaats 500 ml gebufferde 1,5% vleesextract, pH 9,0, verwarmd tot kamertemperatuur in een maatcilinder. Open de filterpatroon behuizing en voeg een voldoende hoeveelheid vleesextract de elektropositieve filter volledig omsluit. Vervang het filterhuis deksel en giet de resterende vlees extract in een steriele beker. Na 1 min van contacttijd, voorbij het rundvlees extract oplossing in de behuizing samen met dat nog in de steriele beker langzaam door het filter met behulp van een druk container of een peristaltische pomp. Vang het eluaat op in een 2 L glazen beker. tweede elutie Herhaal stap 1.1 met behulp van een extra 500 ml gebufferde 1,5% rundvlees extract, Maar verhogen de contacttijd bij stap 1.1.2 tot 15 minuten. Voeg het vlees extract van de tweede elutie om de 2 L beker met dat van de eerste elutie. Voeg een steriele roerstaafje aan de beker. 2. Organische Flocculatie Concentratie Procedure Steriliseren een combinatiepreparaat pH elektrode met 0,525% natriumhypochloriet gedurende tenminste 5 min. Spoel de elektrode met steriele dH 2 O en vervolgens dechlorinate met 0,05 M natriumthiosulfaat. Kalibreer de pH meter behulp pH 4 en 7 normen. Plaats het bekerglas met het eluaat op een roer plaat. Zet de plaat en verhoog de roersnelheid tot een vortex wordt gevormd. De pH van het eluaat tot 3,5 ± 0,1 door langzaam druppelsgewijs toevoegen van 1,2 M HCl aan het eluaat. Voeg het HCl druppelsgewijs omdat snelle toevoeging virus inactiveren. Gedurende deze tijd wordt het eluaat troebel worden als een neerslag begint zich te vormen. Verminder het mengen speed een langzame en roer daarna blijven volgen en handhaven van de pH van het eluaat op 3,5 ± 0,1 bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Giet het neergeslagen vleesextract suspensie in één of meer centrifuge flessen en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 2500 xg bij 4 ° C. Verwijder de flessen uit de centrifuge en ofwel zuig of langzaam decanteer de bovenstaande vloeistof om verlies van het precipitaat gepelleteerd voorkomen. Verwijder het supernatant. OPMERKING: Er kan een aanzienlijke variatie tussen rundvlees extract kavels in de kwantiteit en kwaliteit van de neerslag zijn. Het neerslag geproduceerd uit een aantal percelen zal snel op te lossen, terwijl dat van andere partijen lost met moeite. Voeg 30 ml 0,15 M natriumfosfaat de centrifuge fles met het precipitaat. Gebruik 0,15 M natriumfosfaat, pH 9,0 om een ​​neerslag ontstaat vleesextract partijen die oplossen in 5 min. Roer gedurende 10 minuten na het neerslag volledig is opgelost, en ga dan meteen naar stap 2.7. Gebruik 0,15 M natriumfosfaat, pH 7,0-7,5 voor alle andere neerslagen. Roer gedurende 10-15 min op te lossen, of moeilijker precipitaten, breken ze met een steriele spatel, door herhaaldelijk de oplossing op en neer trekken tijdens het roeren met een pipet, door schudden van de neerslag bij 160 rpm op een ronddraaiende schudder, of door een combinatie van deze procedures. OPMERKING: Bij gebruik van meerdere centrifugefles, combineer het precipitaat met minder dan 30 ml natriumfosfaat en vervolgens het resterende deel van de 30 ml om de flessen te spoelen na het combineren van de neerslag in een fles of beker. Indien de gecombineerde neerslag in een vlakke bodem centrifugefles, voeg een roerstaaf om de fles. Ga naar stap 2.6.5. Indien de gecombineerde neerslag in een centrifuge fles met een conische bodem, deze hoeveelheid in een kleine glazen beker en voeg een roerstaaf in het bekerglas. Plaats de fles of beker op een magneetroerder en roer tot de precipitate volledig opgelost. Opnieuw steriliseren type combinatie pH-elektrode met 0,525% natriumhypochloriet en dechlorinate met 0,05 M natriumthiosulfaat zoals beschreven in stap 2.1. Kalibreer de pH meter behulp pH 7 en 10 standaarden. Langzaam de pH van het volledig opgelost precipitaat 9,0 met 1 M NaOH en vervolgens 10 min geroerd. Verwijder de roerstaaf en centrifugeer de opgeloste precipitaat gedurende 10 min bij 4,000-10,000 xg en 4 ° C. Giet het supernatans in een glazen beker zonder de pellet te verstoren. Voeg een roerstaafje aan de beker en gooi de pellet. Plaats de beker op een magnetische roerder en roer de oplossing. Voeg 1,2 M HCl druppelsgewijs aan de pH op 7,0-7,5. Filter steriliseren het supernatant door het door een steriliserend filter met voorfilter dat was voorbehandeld met 15 ml 1,5% vleesextract, 0,05 M glycine, pH 7,0-7,5. Assay Sample Volume (S) berekeningen: Gebruik vergelijking 1 tot S te berekenen voor alle monsters met uitzondering van het Lab Versterkt Blank en het reagens Lab Blank, vergelijking 1 waarbij D (volume van Original Water Sample getest) is 500 L voor het grondwater, TSV (Total Sample Volume) is het volume van veldmonster doorgegeven via de 5-inch elektronpositieve cartridge filter door het laboratorium ontvangen en FCSV (Final Concentrated Sample Volume) is het volume na filtratie in stap 2.10. Een voorbeeld is te zien in aanvullende materialen Sectie S4.1. Bereken S voor het Lab Versterkte Blank (LFB, dat wil zeggen, een positieve kwaliteitscontrole met behulp van geënte reagenskwaliteit water) en de reagens Lab Blank (LRB, dat wil zeggen, een negatieve kwaliteitscontrole met zuivere water) door de FCSV te vermenigvuldigen met 0,3. Verdeel de FCSV in three deelmonsters. Bereid deelmonsters 1 en 2 met een volume dat gelijk is aan 1,04 maal de Assay Sample Volume. Freeze deze submonsters op of onder -70 ° C als ze niet met de totale kweekbare virustest (subgroep 1, stap 4) kunnen worden geanalyseerd of bewerkt voor het moleculaire assays (niet getoond) binnen 24 uur; anders, houden op 4 ° C. Bevriezen overblijvende volume (deelsteekproef 3) bij of beneden -70 ° C. Bereken de Inoculum Volume door de S delen door 10. 3. Totaal kweekbare Virus quantal Assay NB: Voor alle stappen zorgvuldig altijd oplossingen toe te voegen om te voorkomen dat het verstoren van de cel monolaag. Giet of aspireren media uit testvaten met een monolaag van BGM cellen bij 3-6 dagen na de splitsing en voeg dan een volume van gebalanceerde zoutoplossing gelijk aan de media verwijderd. Giet of zuig het gebalanceerde zoutoplossing uit de celkweek test schepen wordt gebruikt en vervolgens het enten van de celkweek testvaten Inoculeer 10 testbakken voor elk proefmonster met een volume van subgroep 1 gelijk is aan de Inoculum Volume, samen met de totale kweekbare virus quantale assay controles (aanvullende materialen sectie S2.4). Voor de LFB en het Lab Versterkte monstermatrix (LFSM, dwz geënt watermatrix monster) Bereid 5-, 25- en 125-voudige verdunningen gebruikt subgroep 3 en 0,15 M natriumfosfaat, pH 7,0-7,5 als verdunningsmiddel. Een voorbeeld van een procedure voor het maken van verdunningen wordt gegeven in aanvullende materialen sectie S3. Inoculeer 10 gewassen celkweek testvaten elk verdunningsreeks met een Inoculum Volume op een bak naast de vaten geïnoculeerd met onverdunde deelsteekproef 1 in stap 3.2.1. Voor elk monster uit stap 3.2.1 (andere dan die geënt in stap 3.2.2), die CPE heeft in alle 10 replica's na 14 dagen incubatie (zie stap 3.3), prepare 5-, 25- en 125- en 625-voudige verdunningen van subgroep 3. Inoculatie 10 gewassen celkweek testvaten voor elke verdunning serie met behulp van een Inoculum Volume op elk testvat samen met een nieuwe reeks van de totale kweekbare virus quantal assay controles (aanvullende materialen sectie S2.4). Verdeel het inoculum over het oppervlak van de cel monolagen door heen en weer te kantelen de vaten. Incubeer de testvaten bij kamertemperatuur gedurende 80-120 min op een mechanisch schudapparaat 1-5 oscillaties / min of schommelen van de vaten om de 15-20 minuten om eventueel aanwezig virus adsorberen aan cellen. Voeg voorverwarmde onderhoud medium, en vervolgens incubeer de test schepen op 36,5 ± 1 ° C. Kijk voor het verschijnen van CPE in elk testvat behulp van een microscoop per dag gedurende de eerste 3 d en vervolgens onderzoeken ze elke 2-3 dagen tot dag 14. Transfer even welke test vaten, die ≥75% CPE te tonen aan een vriezer ingesteld op ofonder -70 ° C. Freeze alle resterende culturen en de totale kweekbare virus quantale assay controles op of onder -70 ° C na onderzoek van de schepen op de laatste dag. Ontdooi alle culturen en filteren ≥15% van het medium van alle CPE-positieve test vat door een 0,2 um steriliseren filter. Als het voorgeschreven volume niet door het filter kan worden geleid door verstopping, gecentrifugeerd medium gedurende 10 min bij 1,500-18,000 xg en 4 ° C voorafgaand aan filtratie. Voer een tweede passage van 1 ste passage testvaten met behulp van gewassen BGM testbakken. Inoculeer de nieuwe test schepen met een inenting volume dat 10% van de ontdooide medium uit alle negatieve test schepen en van de gefilterde medium van positief schepen vertegenwoordigt. Herhaal de stappen 3.2.4-3.4.3, maar bevriezen elk testvat die negatief op de 1 ste passage en positief op de 2e was zoals beschreven in stap 3.3. Voer een 3 e pasleeftijd als beschreven voor de 2de passage met alleen negatieve controles en test celkweken die negatief in het 1 ste passage positief op 2de passage was. Identiteit van afzonderlijke testvaten als viruspositieve wanneer zij CPE in zowel de 1 e en 2e kanalen of tonen, in het geval dat CPE niet tot de 2de passage, in zowel de 2 en 3 de passages optreedt. Gebruik USEPA Meest Waarschijnlijke Aantal Calculator met het standaardprogramma instellingen zoals weergegeven in Tabel S2 het virus titers van alle monsters berekend. Voer het aantal virus positieve testmonster schepen uit stap 3.6 voor elke test monster in de rekenmachine om de MPN / ml waarde (M ml) en de bovenste (CL UML) en lager (CL LML) 95% -betrouwbaarheidsgrenzen / ml waarden te bepalen . Obtain de MPN / L-waarde (M L) van de desbetreffende test monster met behulp van Vergelijking 2. vergelijking 2 M mL is de MPN / ml waarde in stap 3.7, S is de Assay Sample Volume, en D is het volume van Original Water Sample getest. Bereken de bovenste betrouwbaarheidsinterval / L door het vervangen van de CL UML waarde voor de M mL waarde. Bereken de benedengrens / L door het vervangen van de CL LML waarde voor de M mL waarde. Een rekenvoorbeeld wordt getoond in aanvullende materialen Sectie S4.2. Rapport M mL waarden van 0 als ≤ 1 / D. Bijvoorbeeld, ≤ 0,002 MPN / L (≤ 1/500 L) voor monsters grondwater. Bereken de MPN en 95% betrouwbaarheidsinterval grenswaarden voor elk Lab Versterkte Blank en Lab Re-agent Blank door eerst de waarden / ml verkregen in de rekenmachine door S te vermenigvuldigen en vervolgens het resultaat te delen door 0,3.