وكالة حماية البيئة الطريقة 1615. قياس الفيروسة المعوية وقوع نوروفيروس في المياه عن طريق الثقافة وRT-QPCR. II. مجموع زروع الفحص الفيروسات
Summary
Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.
Abstract
A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency’s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.
Introduction
الفيروسات المعوية هي مجموعة متنوعة من الفيروسات التي تصيب الجهاز المعوي البشري والتي تنتقل من طريق البراز إلى الفم. هذه الفيروسات تدخل مياه السطحية والجوفية من خلال محطة معالجة مياه الصرف الصحي والنفايات السائلة خزان الصرف الصحي، والمصممة بشكل غير صحيح أو كسر خزانات الصرف الصحي، وخطوط الصرف الصحي المكسورة، وتجاوزات الصرف الصحي جنبا إلى جنب، وغيرها من نقطة وغير نقطة مصادر 1-4. الإصابات البشرية ومرض من الفيروسات المنقولة عن طريق المياه تحدث عبر استهلاك المياه الملوثة أو تطهيرها بشكل كاف أو من خلال الترفيهية ملامسة الماء. أعراض المرض قد تنطوي خفيفة الى التهاب المعدة والأمعاء الحاد. التهاب الملتحمة؛ حمى؛ الضائقة التنفسية العليا. مرض اليد و القدم و الفم؛ التهاب عضلة القلب. التهاب السحايا العقيم. التهاب الدماغ؛ شلل؛ الإنتان 5-8، والموت 9،10.
وكالة حماية البيئة أسلوب 1615 يوفر إجراء لقياس المعدية جزيئات الفيروس المعوي في المياه البيئية والشرب. يمكن أن تحتوي هذه المياه علىخليط من virions المعدية وغير المعدية، ولكن الجسيمات المعدية فقط تشكل خطرا على الصحة. تفقد جزيئات الفيروس المعدية العدوى مع مرور الوقت في المياه البيئية والشرب من فقدان النزاهة البروتين قفيصة، الأضرار التي لحقت الأحماض النووية بسبب الأشعة فوق البنفسجية من أشعة الشمس، والأضرار الناجمة عن أي المطهرات التي قد تكون موجودة 11-13. ويستند هذا الإجراء فيروس زروع الكلي المنصوص عليها في طريقة على إنتاج آثار الاعتلال الخلوي (CPE) في خط خلية بافالو الأخضر قرد الكلى (BGM). وقد تم اختيار هذا الخط الخلية بسبب الاستخدام الواسع النطاق في مجال علم الفيروسات البيئي 14،15، على الرغم من أن تقتصر على مجموعة من أنواع الفيروسات المعدية الكشف في المقام الأول إلى بعض الفيروسات المعوية 15. والغرض من هذه الورقة هو وصف الإجراءات طريقة 1615 لشطف من خمسة بوصة مرشحات خرطوشة كهربي، وتركيز الثانوي، وقياس مجموع الفيروسات زروع. تقييم ليوصف أسلوب شامل في Cashdollar وآخرون. 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
وكالة حماية البيئة أسلوب 1615 تم تطويرها للاستخدام خلال دورة الرصد الثالثة على غير المنظم الملوثات تنظيم الرصد (UCMR3) 17 و تهدف في المقام الأول لقياس حدوث الفيروس في المياه الجوفية. وتشترك في عدد من الخطوات المشتركة مع أسلوب جمع المعلومات القاعدة (مجلس النواب)، 15،18 ولكن اثنين من الاختلافات الطفيفة. كلا استخدام فحوصات كمي لقياس الفيروس التي تنتج CPE على الطبقات الوحيدة الخلية BGM مع الكميات التي تستند إلى معظم (MPN) حسابات عدد محتمل. طريقة 1615 يسمح باستخدام فلتر كهربي أحدث لتركيز الفيروس من مختلف المصفوفات المياه ويقلل من عدد من زراعة الخلايا عاء الاختبار نسخ متماثلة في التخفيف من 20 إلى 10. كل التغييرات الطفيفة خفض التكاليف طريقة الشاملة. التخفيض في عدد مكررات يقلل من العمل، ولكن النتائج في حد اكتشاف أقل قليلا. على الرغم من أن من المتوقع أن يكون تركيز أقل من الفيروسات من المياه السطحية المياه الجوفية، 19،20 ثمبلغ (ه) من عينة يعاير خمس مرات من المياه السطحية، وتعويض جزئيا عن الاختلافات. فإن استخدام عدد أقل من مكررات تكون كافية لمعظم المياه السطحية، ولكن بعض سيتطلب تخفيف عينة.
طريقة 1615 لديها العديد من الخطوات الحاسمة والقيود. تختلف مقتطفات لحوم البقر من الكثير الكثير. كل الكثير ينبغي اختبار لفعالية شطف الفيروس والقدرة على تركيز الفيروس من خلال الخطوات تركيز الثانوية كما هو موضح هي مواد تكميلية قسم S2.3. يستخدم الأسلوب الصيغ دقيقة لحساب كمية عينة لتطعيم على مزارع الخلايا BGM وتحديد التتر الفيروس. سيتم إنشاء نتائج غير دقيقة إذا لم يتم اتباع هذه الصيغ بدقة. يجب استخدام تقنية العقيم المناسبة للحفاظ على الثقافات الخلية. غير المصابة BGM الضوابط ثقافة الخلية التي تظهر الضيق أثناء فترة الحضانة لمدة 14 يوما على الأرجح يشير إلى مشاكل مع صيانة ثقافة الخلية. عناية كبيرة يجب أن يكون أيضا تاكين خلال pipetting لالخطوات المتبعة مع تلقيح وبالإضافة المتوسطة لقوارير زراعة الخلايا لتجنب انتقال التلوث. ومراقبة الجودة وصفها في القسم التكميلي المواد S2 يجب اتباعها بدقة. كما يوفر قسم S2 المشورة حل لمشاكل قضايا الجودة.
الآلية الأولى من امتصاص الفيروس إلى كهربي المرشحات هو التفاعل تهمة تتعلق قوة شحنة موجبة على مرشح وقوة الشحنة السالبة للفيروس "تتعلق نقطة تساوي الكهربية والرقم الهيدروجيني للمياه التي يجري اختبارها 21. شطف من المرشحات أيضا يتأثر قوة هذه التفاعلات. لأنها تختلف بين أنواع الفيروسات وحتى بين السلالات داخل نفس النوع، شطف من المرشحات ليست موحدة. وهذا يعني أن أي نتيجة قد نقلل من المستوى الفعلي للفيروس الحالي في المياه البيئية. استخدام خط الخلية BGM واحد أيضا يقلل حدوث الفيروس. النطاقفيروس المعوي التي يمكن أن تنتج CPE في هذا الخط خلية في المقام الأول يقتصر على فيروس شلل الأطفال والأنماط المصلية الأنواع الفيروسة المعوية B وكذلك بعض reoviruses 14،15،22. لن يتم الكشف عن أنواع الفيروسات المعدية الأخرى.
اجتمع المستردة فيروس شلل الأطفال من المياه الجوفية والصف كاشف الطريقة وكالة حماية البيئة 1615 معايير القبول الأداء لكل من تقييم الأداء (PE، أي عينات من المياه المصنف كاشف الصف مع التتر غير معروفة لأحد المحللين التي تستخدم لتقييم أداء المحلل قبل بدء دراسة) وعينات LFB (مواد تكميلية الجدول S1). استعادة 58٪ من المياه الجوفية باستخدام الإجراء الثقافة هي مماثلة لتلك التي ذكرت من قبل الآخرين باستخدام ماء الصنبور 23،24. التقى متوسط التعافي من عينات LFB من 111٪ مع معامل الاختلاف (CV) من 100٪ أيضا معايير القبول أداء طريقة حتى ولو كانت أعلى من تلك التي لوحظت لعينات PE الدرجي في مجلس النواب. مجلس النواب يعني كان الانتعاش بين المختبرات 56٪ مع معامل الاختلاف (CV) من 92٪ في حين المبالغ المستردة intralaboratory متوسط تنوعت 36-85٪ (السير الذاتية 58-131٪، بيانات غير منشورة من قاعدة البيانات النواب PE). وقد لوحظت المبالغ المستردة أعلى في هذه الدراسة لعينات LFB البذور منخفضة من عينات البذور أعلى (122 مقابل 42٪). في الوقت الذي النواب كان يجري التخطيط، كان من المتوقع أن عينات PE تلقي القيم البذور منخفضة سيكون الانتعاش أقل أن أولئك الذين يتلقون بذور عالية. مماثلة لتلك التي لوحظت هنا للحصول على عينات LFB، كان الانتعاش فيروس شلل الأطفال لعينات مجلس النواب PE 71٪ (CV 100٪) و 54٪ (CV 69٪)، و 44٪ (CV 71٪) للقيم البذور ≤300 مبن، 300- 1500 مبن، و> 1500 مبن على التوالي.
هناك العديد من الطرق لقياس الفيروسات المعدية في عينات المياه 25. هذا الأسلوب هو مهم بالنسبة للطرق الأخرى في درجة التوحيد. توحيد يشمل ليس فقط الجودة والأداء الضوابط،ولكنه يستخدم أيضا كميات وصيغ محددة لضمان أن جميع المختبرات التحليلية أداء أسلوب مماثل. دون التوحيد، فمن الصعب مقارنة النتائج بين المختبرات، وبالتالي توحيد ضروري عند إجراء دراسات واسعة النطاق في المختبرات التحليلية متعددة. مع توحيد المدمج في ويمكن توسيع نطاق هذا الأسلوب في المستقبل لتشمل أنواع فيروس إضافية وخطوط الخلايا. وتجري حاليا بحوث لتوفير بيانات لإدراج اتش في الأسلوب.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, for supplying the Sabin poliovirus serotype 3 used in this study; Mary Jean See, Nancy Schable, and Jenifer Jones of Dynamac Corporation for preparation of BGM cultures; Nichole E. Brinkman, Shannon M. Griffin, Brian R. McMinn, Eric R. Rhodes, Eunice A. Varughese, Ann C. Grimm, Sandhya U. Parshionikar, and Larry Wymer for contributions in the overall evaluation of USEPA Method 1615; Gretchen Sullivan for technical assistance; and local private well owners and utilities for allowing us to collect water samples. Although this work was reviewed by USEPA and approved for publication, it may not necessarily reflect official Agency policy. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Beef extract, desiccated powder | BD Bacto | 211520 | |
| Cryogenic tubes | Thermo Fisher | 3775/945373 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | |
| Mechanical rocking platform | Daigger | EF4907G | |
| Orbital shaker | Thermo Fisher | 14-285-729 | |
| Sterilizing filter with prefilter | VWR | 28143-295 | |
| Sterilizing syringe filter | Corning | 431219 | |
| pH Standards | Sigma-Aldrich | 33643, 33646, 33648 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M1018 or M4642 | |
| Leibovitz L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | |
| Sodium bicarbonate, 7.5% | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-139 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Trypsin, EDTA | Invitrogen | 25200072 |
References
- Bradbury, K. R., et al. Source and transport of human enteric viruses in deep municipal water supply wells. Environ. Sci. Technol. 47 (9), 4096-4103 (2013).
- Aslan, A., Xagoraraki, I., Simmons, F. J., Rose, J. B., Dorevitch, S. Occurrence of adenovirus and other enteric viruses in limited-contact freshwater recreational areas and bathing waters. J. Appl. Microbiol. 111 (5), 1250-1261 (2011).
- Begier, E. M., et al. An outbreak of concurrent echovirus 30 and coxsackievirus A1 infections associated with sea swimming among a group of travelers to Mexico. Clin. Infect. Dis. 47 (5), 616-623 (2008).
- Anderson, A. D., et al. A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001. J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).
- Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. Norovirus gastroenteritis. N.Engl.J. Med. 361 (18), 1776-1785 (2009).
- Khetsuriani, N., Lamonte-Fowlkes, A., Oberst, S., Pallansch, M. A. Enterovirus surveillance–United States. MMWR Surveill. Summ. 55 (8), 1-20 (2006).
- Sawyer, M. H. Enterovirus infections: diagnosis and treatment. Semin. Pediatr. Infect. Dis. 13 (1), 40-47 (2002).
- Abzug, M. J., Finn, A., Pollard, A. J. The enteroviruses: an emerging infectious disease? The real, the speculative and the really speculative. Hot Topics in Infection and Immunity in Children. , (2008).
- Harris, J. P., Edmunds, W. J., Pebody, R., Brown, D. W., Lopman, B. A. Deaths from norovirus among the elderly, England and Wales. Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1546-1552 (2008).
- Ho, M., et al. An Epidemic of Enterovirus 71 Infection in Taiwan. New England J. Med. 341 (13), 929-935 (1999).
- Bae, J., Schwab, K. J. Evaluation of murine norovirus, feline calicivirus, poliovirus, and MS2 as surrogates for human norovirus in a model of viral persistence in surface water and groundwater. Appl. Environ. Microbiol. 74 (2), 477-484 (2008).
- Ward, R. L., Knowlton, D. R., Winston, P. E. Mechanism of inactivation of enteric viruses in fresh water. Appl. Environ. Microbiol. 52 (3), 450-459 (1986).
- Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Effects of Source Water Quality on Chlorine Inactivation of Adenovirus, Coxsackievirus, Echovirus, and Murine Norovirus. Appl. Environ. Microbiol. 76 (15), 5159-5164 (2010).
- Dahling, D. R., Wright, B. A. Optimization of the BGM cell line culture and viral assay procedures for monitoring viruses in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 51 (4), 790-812 (1986).
- Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W., Dahling, D. R., Stetler, R. E. EPA/600/R-95/178. ICR Microbial Laboratory Manual. , (1996).
- Cashdollar, J. L., et al. Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water. Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).
- USEPA. 40 CFR Parts 141 and 142 Revisions to the Unregulated Contaminant Monitoring Regulation (UCMR3) for Public Water Systems Final Rule. Federal Register. 77 (85), 26072-26101 (2012).
- USEPA. 40 CFR Part 141 National Primary Drinking Water Regulations: Monitoring Requirements for Public Drinking Water Supplies; Final Rule. Federal Register. 61 (94), 24353-24388 (1996).
- Shaw, S., Regli, S., Chen, J., McGuire, M. J., McLain, J. L., Obolensky, A. Virus occurrence and health risks in drinking water . Information Collection Rule Data Analysis. , 437-462 (2002).
- Lieberman, R. J., et al. . Microbial monitoring of vulnerable public groundwater supplies. , (2002).
- Lukasik, J., Scott, T. M., Andryshak, D., Farrah, S. R. Influence of salts on virus adsorption to microporous filters. Appl. Environ. Microbiol. 66 (7), 2914-2920 (2000).
- Sedmak, G., Bina, D., MacDonald, J. Assessment of an enterovirus sewage surveillance system by comparison of clinical isolates with sewage isolates from milwaukee, wisconsin, collected august 1994. Appl. Environ. Microbiol. 69 (12), 7181-7187 (2003).
- Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water. Appl. Environ. Microbiol. 77 (10), 3500-3506 (2011).
- Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. J Appl Microbiol. 115 (1), 1-11 (2013).
