Summary

Un pez de amamantar Laboratorio Bioensayo para evaluar la actividad antidepredación de metabolitos secundarios de los tejidos de organismos marinos

Published: January 11, 2015
doi:

Summary

Este bioensayo emplea un pez depredador modelo para evaluar la presencia de metabolitos de alimentación-disuasión a partir de extractos orgánicos de los tejidos de organismos marinos naturales en concentraciones utilizando una matriz de comida comparable nutricionalmente.

Abstract

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with the goal of examining the ecological functions of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. The result has been a progression of protocols that have increasingly refined the ecological relevance of the experimental approach. Here we present the most up-to-date version of a fish-feeding laboratory bioassay that enables investigators to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. Organic metabolites of all polarities are exhaustively extracted from the tissue of the target organism and reconstituted at natural concentrations in a nutritionally appropriate food matrix. Experimental food pellets are presented to a generalist predator in laboratory feeding assays to assess the antipredatory activity of the extract. The procedure described herein uses the bluehead, Thalassoma bifasciatum, to test the palatability of Caribbean marine invertebrates; however, the design may be readily adapted to other systems. Results obtained using this laboratory assay are an important prelude to field experiments that rely on the feeding responses of a full complement of potential predators. Additionally, this bioassay can be used to direct the isolation of feeding-deterrent metabolites through bioassay-guided fractionation. This feeding bioassay has advanced our understanding of the factors that control the distribution and abundance of marine invertebrates on Caribbean coral reefs and may inform investigations in diverse fields of inquiry, including pharmacology, biotechnology, and evolutionary ecology.

Introduction

Ecología Química desarrolla a través de la colaboración de los químicos y los ecologistas. Mientras que la especialidad de la ecología química terrestre ha estado alrededor por algún tiempo, el de la ecología química marina es sólo unas pocas décadas, pero ha aportado importantes conocimientos sobre la estructura de la ecología y la comunidad evolutiva de los organismos marinos 1-8. Aprovechando las tecnologías emergentes de buceo y la espectroscopia de RMN, los químicos orgánicos generados rápidamente un gran número de publicaciones que describen nuevos metabolitos de invertebrados y algas marinas bentónicas en los años 1970 y 1980 9. Suponiendo que los metabolitos secundarios deben servir algún propósito, muchas de estas publicaciones atribuidas ecológicamente propiedades importantes a nuevos compuestos sin evidencia empírica. Casi al mismo tiempo, los ecologistas también se están aprovechando de la llegada de buceo y la descripción de la distribución y abundancia de animales bentónicos y plantas conocidas previamente froestoy métodos de muestreo relativamente ineficaces como el dragado. La asunción de estos investigadores era que nada sésiles y de cuerpo blando deben ser defendidos químicamente para evitar el consumo por los depredadores 10. En un esfuerzo por introducir el empirismo a lo que era el trabajo de otra manera descriptiva sobre la abundancia de especies, algunos ecologistas comenzaron extrapolando defensas químicas a partir de ensayos de toxicidad 11. La mayoría de los ensayos de toxicidad implicaron la exposición del pescado entero u otros organismos a las suspensiones acuosas de extractos orgánicos crudos de tejidos de invertebrados, con la posterior determinación de las concentraciones en masa seca de los extractos responsables de matar a la mitad de los organismos de ensayo. Sin embargo, los ensayos de toxicidad no emulan la manera en que los depredadores potenciales perciben presa en condiciones naturales, y estudios posteriores no han encontrado relación entre la toxicidad y la palatabilidad 12-13. Es sorprendente que las publicaciones en revistas de prestigio utilizan técnicas que tienen poca o ninguna ecological relevancia 14-15 y que estos estudios son aún ampliamente citados hoy. Es aún más alarmante observar que los estudios basados ​​en datos de toxicidad se siguen publicando 16-18. El método de bioensayo descrito en este documento se elaboró ​​a finales de 1980 para proporcionar un enfoque ecológicamente relevante para los ecologistas químicos marinos para evaluar las defensas químicas antidepredación. El método requiere un modelo depredador para muestrear un extracto orgánico crudo desde el organismo diana a una concentración natural en una matriz alimentaria nutricionalmente comparable, proporcionando datos palatabilidad que son ecológicamente más significativa que los datos de toxicidad.

El enfoque general a la evaluación de la actividad antidepredación de los tejidos de organismos marinos incluye cuatro criterios importantes: (1) un depredador generalista apropiado debe ser utilizado en ensayos de alimentación, (2) los metabolitos orgánicos de todas las polaridades deben ser exhaustiva extraído del tejido de la orientar organismo, (3) los metabolitos deben be mezclado en un alimento experimental nutricionalmente adecuada a la misma concentración volumétrica tal como se encuentra en el organismo a partir del cual fueron extraídos, y (4) el diseño experimental y enfoque estadístico deben proporcionar una métrica significativa para indicar mal sabor relativa.

El procedimiento descrito a continuación está diseñado específicamente para evaluar las defensas químicas antidepredación en los invertebrados marinos del Caribe. Empleamos el pez cabeza azul, Thalassoma bifasciatum, como un pez depredador modelo porque esta especie es común en los arrecifes de coral del Caribe y se sabe que degustar una amplia variedad de invertebrados bentónicos 19. Tejido del organismo diana se extrae primero, a continuación, se combina con una mezcla de alimentos, y, finalmente, se ofreció a los grupos de T. bifasciatum para observar si rechazan los alimentos tratados con extracto. Los datos de ensayo que utilizan este método han aportado importantes conocimientos sobre la química defensiva de los organismos marinos 12,20-21, lhistoria ife compensaciones 22-24 y ecología de comunidades 25-26.

Protocol

NOTA: El paso 3 de este protocolo implica sujetos animales vertebrados. El procedimiento ha sido diseñado para que los animales reciben el tratamiento más humana posible y ha sido aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de Carolina del Norte en Wilmington. 1) La extracción de tejidos Utilice tejido que se encuentra en su estado natural de hidratación y no exprimido, reseca o demasiado húmedo ya que esto alterará la concentrac…

Representative Results

Aquí mostramos los resultados de este bioensayo para seis especies de esponjas del Caribe comunes (Figura 2). Estos datos fueron publicados inicialmente en 1995 por Pawlik et al. 12 y demuestran el poder de este enfoque para estudiar las diferencias en las estrategias de defensa química entre concurrentes taxones. Los resultados se presentaron como una media del número de bolitas de comida comido + error estándar (SE) para cada especie. Casi no hay sedimentos se comen en ensayos …

Discussion

El procedimiento descrito en este documento proporciona un protocolo relativamente simple, de laboratorio ecológicamente relevante para la evaluación de las defensas químicas antidepredación en los organismos marinos. En este artículo revisamos los criterios importantes que son satisfechas por este conjunto de métodos:

(1) predador apropiado. Este ensayo de alimentación emplea el pez cabeza azul, Thalassoma bifasciatum, uno de los peces más abundantes en los arrecif…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank James Maeda and Aaron Cooke for assistance with the filming and editing of this video. Funding was provided by the National Science Foundation (OCE-0550468, 1029515).

Materials

Dichloromethane Fisher Scientific D37-20
Methanol Fisher Scientific A41220
Anhydrous Calcium Chloride Fisher Scientific C614-500
Cryocool Heat Transfer Fluid Fisher Scientific 20-548-146 For vacuum concentrator
Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity MP Biomedicals 154723
Squid mantle rings N/A N/A Can be purchased at grocery store
Denatonium benzoate Aldrich D5765
50 ml graduated centrifuge tube Fisher Scientific 14-432-22
20 ml scintillation vial Fisher Scientific 03-337-7
Disposable Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Rubber bulbs for Pasteur pipets Fisher Scientific 03-448-24
Red bulbs for pellet delivery Fisher Scientific 03-448-27
250 ml round-bottom flask Fisher Scientific 10-067E
Scintillation vial adapter for rotavap Fisher Scientific K747130-1324
Weightboats Fisher Scientific 02-202B
Microspatula Fisher Scientific 21-401-10
5 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-53
10 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-54
Razor blade Fisher Scientific S17302

References

  1. Paul, V. J., ed, . Ecological roles of marine natural products. , (1992).
  2. Pawlik, J. R. Marine invertebrate chemical defenses. Chemical Reviews. 93 (5), 1911 (1993).
  3. Hay, M. E. Marine chemical ecology: what's known and what's next. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 44 (5), 476-476 (1996).
  4. McClintock, J. B., Baker, B. J. . Marine Chemical Ecology. , (2001).
  5. Amsler, C. D. . Algal Chemical Ecology. , (2008).
  6. Hay, M. E. Marine chemical ecology: Chemical signals and cues structure marine populations, communities, and ecosystems. Annual Review of Marine Science. 1, 193-212 (2009).
  7. Pawlik, J. R. The chemical ecology of sponges on Caribbean reefs: Natural products shape natural systems. BioScience. 61 (11), 888 (2011).
  8. Pawlik, J. R. Antipredatory Defensive Roles of Natural Products from Marine Invertebrates. Handbook of Marine Natural Products. , 677-710 (2012).
  9. Pawlik, J. R., Amsler, C. D., Ritson-Williams, R., McClintock, J. B., Baker, B. J., Paul, V. J. Marine Chemical Ecology: A Science Born of Scuba. . Research and Discoveries: The Revolution of Science through Scuba. 39, 53-69 (2013).
  10. Randall, J. E., Hartman, W. D. Sponge-feeding fishes of the West Indies. Marine Biology. 1, 216-225 (1968).
  11. Bakus, G. J., Green, G. Toxicity in sponges and holothurians — geographic pattern. Science. 185, 951-953 (1974).
  12. Pawlik, J. R., Chanas, B., Toonen, R. J., Fenical, W. Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish. 1. Chemical deterrency. Marine Ecology Progress Series. 127, 183-194 (1995).
  13. Schulte, B. A., Bakus, G. J. Predation deterrence in marine sponges — laboratory versus field studies. Bulletin of Marine Science. 50, 205-211 (1992).
  14. Jackson, J. B. C., Buss, L. Allelopathy and spatial competition among coral reef invertebrates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72, 5160-5163 (1975).
  15. Bakus, G. J. Chemical defense mechanisms on the great barrier reef. Australia. Science. 211, 497-499 (1981).
  16. Gemballa, S., Schermutzki, F. Cytotoxic haplosclerid sponges preferred: a field study on the diet of the dotted sea slug Peltodoris atromaculata (doridoidea: nudibranchia). Marine Biology. 144, 1213-1222 (2004).
  17. Voogd, N. J., Cleary, D. F. R. Relating species traits to environmental variables in Indonesian coral reef sponge assemblages. Marine and Freshwater Research. 58, 240-249 (2007).
  18. Mollo, E., et al. Factors promoting marine invasions: a chemolecological approach. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 4582-4586 (2008).
  19. Randall, J. E. Food habits of reef fishes of the West Indies. Studies in Tropical Oceanography. 5, 665-847 (1967).
  20. O’Neal, W., Pawlik, J. R. A reappraisal of the chemical and physical defenses of Caribbean gorgonian corals against predatory fishes. Marine Ecology Progress Series. 240, 117-126 (2002).
  21. Hines, D. E., Pawlik, J. R. Assessing the antipredatory defensive strategies of Caribbean non-scleractinian zoantharians (Cnidaria): is the sting the only thing. Marine Biology. 159 (2), 389-398 (2012).
  22. Walters, K. D., Pawlik, J. R. Is there a trade-off between wound-healing and chemical defenses among Caribbean reef sponges. Integrative and Comparative Biology. 45 (2), 352-358 (2005).
  23. Leong, W., Pawlik, J. R. Evidence of a resource trade-off between growth and chemical defenses among Caribbean coral reef sponges. Marine Ecology Progress Series. 406, 71-78 (2010).
  24. Leong, W., Pawlik, J. R. Comparison of reproductive patterns among 7 Caribbean sponge species does not reveal a resource trade-off with chemical defenses. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 401 (1-2), 80-84 (2011).
  25. Pawlik, J. R., Loh, T. -. L., McMurray, S. E., Finelli, C. M. Sponge Communities on Caribbean Coral Reefs Are Structured by Factors That Are Top-Down, Not Bottom-Up. PLoS ONE. 8 (5), e62573 (2013).
  26. Loh, T. -. L., Pawlik, J. R. Chemical defenses and resource trade-offs structure sponge communities on Caribbean coral reefs. Proceedings of the National Academy of Science. 111, 4151-4156 (2014).
  27. Miller, A. M., Pawlik, J. R. Do coral reef fish learn to avoid unpalatable prey using visual cues. Animal Behaviour. 85, 339-347 (2013).
  28. Pawlik, J. R., Fenical, W. A re-evaluation of the ichthyodeterrent role of prostaglandins in the Caribbean gorgonian coral, Plexaura homomalla. Marine Ecology Progress Series. 52, 95-98 (1989).
  29. Fenical, W., Pawlik, J. R. Defensive properties of secondary metabolites from the Caribbean gorgonian coral Erythropodium caribaeorum. Marine Ecology Progress Series. 75, 1-8 (1991).
  30. Pawlik, J. R., Fenical, W. Chemical defense of Pterogorgia anceps, a Caribbean gorgonian coral. Marine Ecology Progress Series. 87, 183-188 (1992).
  31. Chanas, B., Pawlik, J. R. Does the skeleton of a sponge provide a defense against predatory reef fish. Oecologia. 107 (2), 225-231 (1996).
  32. Chanas, B., Pawlik, J. R., Lindel, T., Fenical, W. Chemical defense of the Caribbean sponge Agelas clathrodes (Schmidt). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 208 (1-2), 185-196 (1997).
  33. Wilson, D. M., Puyana, M., Fenical, W., Pawlik, J. R. Chemical defense of the Caribbean reef sponge Axinella corrugata against predatory fishes. Journal of Chemical Ecology. 25 (12), 2811-2823 (1999).
  34. Chanas, B., Pawlik, J. R. Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish II. Spicules, tissue toughness, and nutritional quality. Marine Ecology Progress Series. 127 (1), 195-211 (1995).
  35. Albrizio, S., Ciminiello, P., Fattorusso, E., Magno, S., Pawlik, J. R. Amphitoxin, a new high molecular weight antifeedant pyridinium salt from the Caribbean sponge Amphimedon compressa. Journal of Natural Products. 58 (5), 647-652 (1995).
  36. Assmann, M., Lichte, E., Pawlik, J. R., Köck, M. . Chemical defenses of the Caribbean sponges Agelas wiedenmayeri and Agelas conifera. Marine Ecology Progress Series. 207, 255-262 (2000).
  37. Kubanek, J., Fenical, W., Pawlik, J. R. New antifeedant triterpene glycosides from the Caribbean sponge Erylus Formosus. Natural Product Letters. 15 (4), 275-285 (2001).
  38. Pawlik, J. R., McFall, G., Zea, S. Does the odor from sponges of the genus Ircinia protect them from fish predators. Journal of Chemical Ecology. 28 (6), 1103-1115 (2002).
  39. Waddell, B., Pawlik, J. R. Defenses of Caribbean sponges against invertebrate predators. I. Assays with hermit crabs. Marine Ecology Progress Series. 195, 125-132 (2000).
  40. Waddell, B., Pawlik, J. R. Defense of Caribbean sponges against invertebrate predators. II. Assays with sea stars. Marine Ecology Progress Series. 195, 133-144 (2000).
  41. Burns, E., Ifrach, I., Carmeli, S., Pawlik, J. R., Ilan, M. Comparison of anti-predatory defenses of Red Sea and Caribbean sponges. I. Chemical defense. Marine Ecology Progress Series. 252, 105-114 (2003).
  42. Jones, A. C., Blum, J. E., Pawlik, J. R. Testing for defensive synergy in Caribbean sponges: Bad taste or glass spicules. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 322 (1), 67 (2005).

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Cite This Article
Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).

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