Ein Farbtest, die speziell Maßnahmen Granzyme B Proteolytische Aktivität: Hydrolyse von Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl
Summary
We describe a simple, quantitative colorimetric assay that specifically measures the proteolytic activity of human, mouse or rat Granzyme B (GzmB). This protocol can be easily adapted for determining protease activity of other granule serine proteases by the hydrolysis of other synthetic peptide substrates with an appropriate recognition sequence.
Abstract
The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is the most studied granzyme in humans and mice and therefore, researchers need specific and reliable tools to study its function and role in pathophysiology. This especially necessitates assays that do not recognize proteases such as caspases or other granzymes that are structurally or functionally related. Here, we apply GzmB’s preference for cleavage after aspartic acid residues in a colorimetric assay using the peptide thioester Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. GzmB is the only mammalian serine protease capable of cleaving this substrate. The substrate is cleaved with similar efficiency by human, mouse and rat GzmB, a property not shared by other commercially available peptide substrates, even some that are advertised as being suitable for this purpose. This protocol is demonstrated using unfractionated lysates from activated NK cells or CTL and is also suitable for recombinant proteases generated in a variety of prokaryotic and eukaryotic systems, provided the correct controls are used. This assay is a highly specific method to ascertain the potential pro-apoptotic activity of cytotoxic molecules in mammalian lymphocytes, and of their recombinant counterparts expressed by a variety of methodologies.
Introduction
Granzyme sind eine Familie von Serin-Proteasen, die in den sekretorischen Lysosomen von natürlichen Killerzellen (NK) und zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) 1 gefunden. Fünf verschiedene Granzyme im Menschen vorhanden (A, B, H, K und M), und zehn Mäuse (A – G, K, M und N) 2,3. Granzyme A und Granzyme B (GZMA, GzmB) sind die häufigsten und wurden umfangreich im menschlichen und Nagetier-Einstellung untersucht.
Die klassische Funktion GzmB ist die Induktion von Apoptose in Zielzellen in Verbindung mit der porenbildende Protein von Perforin, Granzym, die die an die Zielzelle Cytosol 4 Zugriff ermöglicht ausgeführt. Obwohl GzmB Expression unzweideutig in zytotoxischen Lymphozyten haben neuere Studien wurden zu einer Vielzahl anderer GzmB exprimierenden Zelltypen, einschließlich, aber nicht beschränkt Keratinozyten 5, 6 Basophilen, Mastzellen 7, plasmacytoid dendritischen Zellen 8, 9 und B-Zellen, 10.In diesem Zusammenhang wurden nicht-apoptotischen GzmB Funktionen ergeben, die von der Teilnahme an entzündlichen Prozessen, Gewebeumbau und anderen immunregulatorischen Eigenschaften 14.11.
Da eine breitere biologische Rolle für GzmB als bisher vermutet vorgeschlagen, Forschern erfordern zuverlässige und spezifische Werkzeuge für die Erkennung. Von Vorteil ist, GzmB die ausdrückliche Verpflichtung, in der Carboxylseite von Asparaginsäurereste, eine Eigenschaft, einzigartig unter den eukaryotischen Serinproteasen 15 zu spalten. Maus, Ratte und Mensch sind GzmB strukturell sehr ähnlich, aber die erweiterten Substratspezifität der Maus GzmB unterscheidet dezent von der Ratte und Mensch 16, was bedeutet, dass bestimmte allgemeine Substraten mit Asp an der Klemme (P1) effizient durch GzmB gespalten von allen drei Spezies, während andere Substrate mit komplizierteren Sequenzen stromaufwärts von P1 kann stark unterschiedliche Ergebnisse ergeben. In der Vergangenheit und neuere literature hat diese Tatsache erhebliche Verwirrung und Fehlinterpretation der biologische Bedeutung einiger experimenteller Befunde verursacht, obwohl sorgfältig kontrolliert wurden kinetische Untersuchungen versucht, die Lage 17 zu korrigieren.
In dieser Arbeit haben wir versucht, diese Punkte unter Verwendung von zwei im Handel erhältliche Substrate, nämlich Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl und N-acetyl-Ile-Glu-Pro-Asp-p-Nitroanilid zu illustrieren. Die beiden Reagenzien zu tun erzeugen unterschiedliche reaktive Gruppen nach der Spaltung (eine freie Sulfhydryl gegenüber einer Leuchtstoff kostenlos Paranitroanilid), aber dies berührt in keiner Weise auf die proteolytische Spaltung. Das beschriebene Protokoll ist eine moderne Adaption eines sehr alten Protokoll 18, sollte aber helfen Forschern, die verschiedenen GzmB Substrate angemessen zu nutzen, sondern schafft auch einen methodischen Rahmen zur Erfassung der Aktivität von anderen Granzyme wie GZMA und GzmH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Historisch die Granzyme wurden als Schlüssel Effektormoleküle zytotoxischer Lymphozyten (CTL und NK-Zellen), die zur Induktion einer schnellen apoptotischen Tod in Zielzellen identifiziert. Dies war vor allem auf die Wirkung von GzmB, das Zielsubstrat Moleküle an Aspartat (D) Reste gespalten und somit konnte die Caspase-Kaskade von beiden spalten pro-Caspasen zu aktivieren, sowie mehrere ihrer nachgelagerten Ziele. Es ist jedoch nun ersichtlich, dass GzmB Expression ist nicht auf lymphoide zytotoxischen Zellen beschr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work received support through grant HA 6136/1-1 from the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) to MH. JAT is supported by Program and Project Grants from the National Health and Medical Research Council of Australia.
Materials
| Product | Company | Catalogue number | Comment/description |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SMSB05 | Granzyme B substrate (mouse and human) |
| Ac-IEPD-pNA | SM Biochemicals LLC, CA | SMPNA009 | Granzyme B substrate (only human) |
| N-a-CBZ-L-lysine-S-Bzl | Sigma-Aldrich | C3647 | Granzyme A substrate |
| Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SB025 | Granzyme H substrate |
| 5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Sigma-Aldrich | D8130 | DTNB, Ellman’s Reagent |
| NK cell isolation kit II mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-892 | negative selection kit |
| NK cell isolation kit human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-657 | negative selection kit |
| Plate reader | Biorad iMark | Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3 | |
| Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate | Corning, MA, USA | 2797 |
References
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