Radial Mobilità e citotossico Funzione retrovirale Replica vettoriale trasdotte, non aderente Alloresponsive Linfociti T
Summary
We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.
Abstract
Riportiamo un romanzo adattamento del dosaggio migrazione cellulare Monolayer radiale, prima riferito a misurare la migrazione radiale delle cellule tumorali aderenti su proteine della matrice extracellulare, per misurare la motilità, umane non aderente o effettrici murine cellule immunitarie fluorescenza marcata. Questa tecnica utilizza un collettore in acciaio inox e 10 ben scorrevole in Teflon per depositare focally cellule T non aderenti nei pozzetti preparati sia con monostrati confluenti di cellule tumorali o proteine della matrice extracellulare. Luce e / o multicanale microscopia a fluorescenza viene utilizzato per monitorare il movimento e il comportamento delle cellule effettrici nel tempo. Coloranti fluorescenti e / o vettori virali che codificano per transgeni fluorescenti sono usati per etichettare in modo differenziato i tipi di cellule per l'imaging. Questo metodo è distinto da simile tipo in vitro che traccia orizzontale o verticale migrazione / invasione utilizzando camere di diapositive, agar o transwell piatti. Il test permette di dati dettagliati di imaging a Be raccolti con differenti tipi cellulari caratterizzati da marcatori fluorescenti specifici; anche sottopopolazioni di cellule specifiche (ad esempio, trasdotte / nontransduced) possono essere monitorati. Superficie trame fluorescenza intensità vengono generati utilizzando i canali di fluorescenza specifici corrispondenti al tipo di cellula migrazione. Questo permette una migliore visualizzazione della mobilità non aderenti delle cellule immunitarie in momenti specifici. È possibile raccogliere prove di altre funzioni delle cellule effettrici, quali citotossicità o il trasferimento di vettori virali da effettore alle cellule bersaglio, pure. Così, il metodo permette ai ricercatori di documentare microscopicamente cellula-cellula interazioni di differenzialmente-marcato, non aderente con cellule aderenti di vario tipo. Tali informazioni possono essere particolarmente rilevanti nella valutazione di tipi di cellule immunitarie biologicamente manipolati o attivati, in cui la prova visiva della funzionalità si desideri con cellule bersaglio tumorale prima di utilizzarli per la terapia del cancro.
Introduction
Il test di migrazione cellulare monostrato Radial è stato originariamente sviluppato per misurare le proprietà infiltrative delle cellule tumorali aderenti 1-4 su vetrini rivestiti con matrice extracellulare (ECM) proteine 5-7 o con i componenti ECM individuali, come la fibronectina o laminina 1,2. La tecnica coinvolto seminare una sospensione di cellule singole cellule tumorali nel centro di pozzetti usando un collettore sedimentazione cellulare acciaio inossidabile (CSM). Dopo sedimentazione, le cellule tumorali sarebbero aderire al fondo del pozzo e la variazione del diametro della popolazione cellulare iniziale nel tempo usato per stabilire un tasso di motilità orizzontale. Il test di migrazione cellulare monostrato Radial ha fornito un vantaggio visivo rispetto ad altri metodi esistenti che impiegavano transwell piastre per saggio le capacità migratorie in vitro di cellule; questi test non sono favorevoli alla formazione immagine 8. Come pure, ha fornito anche una grande quantità di libertà nella scelta del timepoints in sede di valutazione della migrazione, senza alcun limite al numero di timepoints un ricercatore potrebbe scegliere di immagine dopo la sedimentazione.
Poiché la capacità di migrare è una funzionalità importante per le cellule non aderenti, soprattutto nella zona di immunoterapia o dove possono essere utilizzate come veicoli di consegna per vettori virali, abbiamo adattato l'uso del CSM per valutare la migrazione di cellule non aderenti tipi su monostrati di cellule tumorali, in aggiunta alle proteine ECM. Il vantaggio di microscopicamente visualizzare la migrazione delle cellule non aderenti su monostrati di cellule tumorali vitali, il ECM complesso isolato dal tumore, o sui componenti ECM singoli rende questo test versatile. Saggi che utilizzano pozzi rivestiti con una singola proteina extracellulare non riflettono accuratamente il substrato tessuti ECM o tumore delle cellule sarebbero migrare attraverso in vivo.
Qui, abbiamo usato alloreattivi linfociti T citotossici (alloCTL), sensibilizzati ai principali histocompcomplesso atibilità (MHC) proteine utilizzando reazioni a senso unico di cellule tumorali linfocitaria mista (MLTR) o reazioni linfociti misti (MLR) 9, come il nostro tipo di cella non aderente rappresentante. Abbiamo testato le celle sia di origine umana e murina. Quando la migrazione è stata misurata su monostrati tumorali, le cellule tumorali sono state impiegate obiettivi parzialmente rilevanti, mostrando alcune delle stesse proteine MHC presenti nella popolazione cellulare utilizzato per sensibilizzare gli effettori, o obiettivi pienamente rilevanti, con una serie completa di molecole MHC che la effettori erano stati sensibilizzati verso. In alcuni esperimenti, abbiamo usato CellTracker fluorescente Red CMPTX o proliferazione cellulare dye eFluor 670 di distinguere tra cellule effettrici e di destinazione. Abbiamo anche utilizzato la trasduzione con codifica vettori virali per proteine fluorescenti come un ulteriore modo per visualizzare le cellule. Per alcuni test, abbiamo transdotte la alloCTL con vettori retrovirali replicanti (RRV) che codificano per Emerald Green (EMD) proteina fluorescente 10,11; per OTHERS, le cellule tumorali sono state trasdotte con vettori lentivirali codificanti per mStrawberry.
Il alloCTL sono stati seminati attraverso un canale del collettore al centro di entrambi i monostrati di cellule tumorali o ECM raccolti da monostrati cellulari tumorali. Interazioni delle cellule aderenti e non aderenti sono state visualizzate mediante luce e / o mediante microscopia a fluorescenza nel tempo. Turbativa in monostrato cellula tumorale a bassa potenza, o tumore cellule con nuclei frammentati ad alta potenza sono indicatori di danno cellulare da lisi e apoptosi, rispettivamente. Abbiamo creato digitalmente mappe fluorescenti di intensità superficie che mostrano la migrazione di cellule fluorescenti T non aderenti sulle colture monostrato. Abbiamo notato anche la citotossicità generato per l'aderente monostrato cellulare glioma dopo la formazione di cluster del sovrapposto alloCTL non aderente. Come pure, è stato osservato trasduzione orizzontale RRV-EMD dalla alloCTL al monostrato glioma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le cellule tumorali in una sospensione di cellule singole sono stati pipettati nei pozzetti di una slitta Teflon mascherato. Le cellule potevano aderire e poi formate monostrati in un umidificata al 5% di CO 2, 37 ° C incubatore (Figura 1A). Monostrati affermati o proteine ECM derivati dal monostrato potrebbero essere raccolti per questi test (Figura 1B). T effettrici linfociti marcati con coloranti fluorescenti vitali o trasdotte con vettori codificanti per EMD …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supportato in parte dal NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI Concessione Numero UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, e Joan S. Holmes Memorial Fund Research. MJH e GCO ricevuti sostenuto dalla Joan S. Holmes Memorial Postdoctoral Fellowship presso la UCLA. Il dispositivo CSM è stato ottenuto da creativi metodi scientifici: www.creative-sci.com. Il vettore lentivirale è stato ricevuto dal UCLA Vector core, che è supportato da CURE / P30 DK041301.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μL Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μL Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μL pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
References
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