Radial Mobiliteit en cytotoxische functie van retrovirale replicerende vector getransduceerde, niet-klevende Alloresponsive T-lymfocyten
Summary
We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.
Abstract
Wij rapporteren een nieuwe aanpassing van de radiale monolaag celmigratie analyse, voor het eerst bij de radiale migratie van hechtende tumorcellen op extracellulaire matrixeiwitten maat voor meting van de motiliteit van fluorescent-gelabelde, niet-hechtende menselijke of murine effector immuuncellen. Deze techniek maakt gebruik van een roestvrij stalen spruitstuk en 10 putjes Teflon dia focaal niet-hechtende T-cellen storten putjes bereid met ofwel confluente monolagen tumorcellen of extracellulaire matrixeiwitten. Licht en / of multi-channel fluorescentie microscopie gebruikt om de bewegingen en het gedrag van de effector cellen te volgen in de tijd. Fluorescente kleurstoffen en / of virale vectoren die coderen voor fluorescerende transgenen worden gebruikt om differentieel labelen celtypen voor beeldvorming. Deze methode onderscheidt zich van soortgelijke type in vitro testen die horizontale of verticale migratie / invasie gebruik te maken van dia kamers, agar of transwell borden volgen. De test maakt het mogelijk gedetailleerde beeldvorming gegevens naar be verzameld verschillende celtypen onderscheiden door specifieke fluorescente merkers; zelfs specifieke subpopulaties van cellen (dat wil zeggen getransduceerd / nontransduced) kan worden gecontroleerd. Oppervlakte fluorescentie intensiteit plots worden gegenereerd middels fluorescentie kanalen die overeenkomen met het type migrerende cel. Dit zorgt voor een betere visualisatie van de niet-hechtende immune mobiliteit cel op specifieke tijden. Het is mogelijk om het bewijs van andere effector celfuncties, zoals cytotoxiciteit of overdracht van virale vectoren van effectorcellen verzamelen aan doelcellen, ook. Zo is de methode stelt onderzoekers microscopisch document cel-cel interacties van differentieel gelabelde, niet-hechtende met hechtende cellen van verschillende soorten. Dergelijke informatie kan met name relevant voor de beoordeling van biologisch-gemanipuleerd of geactiveerde immuunsysteem celtypen, waar visueel bewijs van functionaliteit gewenst is met tumordoelcellen cellen vóór het gebruik ervan voor de behandeling van kanker zijn.
Introduction
De radiale monolaag celmigratie assay werd oorspronkelijk ontwikkeld om de infiltrative eigenschappen hechtende tumorcellen 1-4 meten op objectglaasjes bekleed met extracellulaire matrix (ECM) proteïnen 5-7 of afzonderlijke ECM componenten zoals fibronectine of laminine 1,2. De techniek betrokken zaaien een enkele celsuspensie van tumorcellen in het centrum van putjes met een roestvrij stalen cel sedimentatie verdeelstuk (CSM). Na sedimentatie, zou de tumorcellen hechten aan de bodem van de put en de verandering in de diameter van de initiële celpopulatie tijd werd gebruikt om een hoeveelheid van horizontale motiliteit vast. De radiale monolaag celmigratie analyse leverde een visueel voordeel boven andere bestaande methodes die transwell platen om de in vitro migratie capaciteiten van cellen assay toegepast; Deze testen zijn niet bevorderlijk imaging 8. Als goed, zij ook een grote mate van vrijheid in het kiezen van het tijdstips wanneer de migratie wordt beoordeeld, met geen limiet op het aantal tijdstippen een onderzoeker kon kiezen om het beeld na sedimentatie.
Omdat het vermogen om te migreren een belangrijke functionaliteit voor niet-hechtende cellen, vooral op het gebied van immunotherapie of wanneer deze kunnen worden gebruikt als afgiftevehikels voor virale vectoren, passen wij het gebruik van de CSM om de migratie van niet-hechtende cellen te evalueren types op tumorcel monolagen, naast ECM eiwitten. Het extra voordeel van microscopisch visualiseren migratie van niet-hechtende cellen op levensvatbare tumorcellen monolagen op complexe ECM geïsoleerd uit de tumor, of op afzonderlijke ECM componenten maakt deze assay veelzijdig. Testen die putten gecoat met een enkel extracellulair proteïne in dienst weerspiegelen niet nauwkeurig de ECM weefsel substraat of tumor van de cellen zou door migreren in vivo.
Hier hebben we gebruikt alloreactieve cytotoxische T-lymfocyten (alloCTL), lichtgevoelig tot grote histocompatibility complex (MHC) eiwitten met een enkele gemengde lymfocyt tumorcel reactie (MLTR) of gemengde lymfocyt reactie (MLR) 9 onze representatieve niet-hechtende celtype. We testten cellen van zowel menselijke en murine oorsprong. Toen migratie werd gemeten tumor monolagen, de tumorcellen toegepast werden ofwel gedeeltelijk relevant targets, tonen enkele van dezelfde MHC-eiwitten op de celpopulatie gebruikt om de effectoren of volledig relevante doelen sensibiliseren met een volledige set van MHC moleculen die de effectoren werden gesensibiliseerd richting. In sommige experimenten gebruikten we fluorescerende CellTracker Rode CMPTX of celproliferatie kleurstof eFluor 670 om onderscheid te maken tussen effector en doelcellen. Wij gebruikten ook transductie met virale vectoren coderen voor fluorescerende eiwitten als een extra manier om de cellen te visualiseren. Voor bepaalde tests, we getransduceerde de alloCTL met retrovirale replicerende vectoren (RRV) codering voor Emerald Green (EMD) fluorescerend eiwit 10,11; voor others, tumorcellen getransduceerd met lentivirale vectoren die coderen voor mStrawberry.
De alloCTL werden geënt door een kanaal van het verdeelstuk naar het centrum van beide tumorcel monolagen of ECM geoogst van tumorcellen monolagen. Hechtende en niet-hechtende cel interacties werden gevisualiseerd door licht en / of door fluorescentie microscopie tijd. Verstoring in de tumorcel monolaag bij laag vermogen, of tumorcellen met gefragmenteerde kernen op hoog vermogen waren indicatoren van celschade door lysis en apoptose, respectievelijk. We digitaal gemaakt oppervlak intensiteit fluorescerende kaarten die de migratie van niet-klevende fluorescerende T-cellen in de monolaag culturen. We hebben ook kennis genomen van de cytotoxiciteit veroorzaakt aan de aanhanger glioom celmonolaag na clustervorming van de overlay niet hechtende alloCTL. Als goed, horizontale transductie van RRV-EMD uit de alloCTL aan de glioom monolaag werd waargenomen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tumorcellen in een enkele celsuspensie werd gepipetteerd in de putjes van een met teflon gemaskeerd slide. De cellen werden toegestaan te hechten en vervolgens gevormd monolagen in een bevochtigde 5% CO2, 37 ° C incubator (figuur 1A). Gevestigde monolagen of ECM eiwitten van de monolaag kunnen worden geoogst voor deze testen (Figuur 1B). Effector T lymfocyten gelabeld met fluorescerende vitale kleurstoffen of getransduceerd met vectoren die coderen voor EMD werden geza…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mede ondersteund door NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI Grant Aantal UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, en de Joan S. Holmes Fund Memorial Research. MJH en GCO ontvangen ondersteund vanuit de Joan S. Holmes Memorial Postdoctorale Fellowship aan de UCLA. De CSM-apparaat werd verkregen van Creative Scientific Methods: www.creative-sci.com. De lentivirale vector werd ontvangen van het UCLA Vector Core, ondersteund door CURE / P30 DK041301.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μL Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μL Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μL pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
References
- Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells. Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay. Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).
- Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells. Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).
- Berens, M. E., Beaudry, C. Radial monolayer cell migration assay. Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).
- Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E. Determinants of human astrocytoma migration. Cancer Res. 54 (14), 3897-3904 (1994).
- Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix. Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Hickey, M. J., et al. Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas. Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).
- Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma. Mol Ther. 12, 842-851 (2005).
- Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing. J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).
- Koya, R. C., et al. Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).
- Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation. J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).
- Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. 3-D extracellular matrix from sectioned human tissues. Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).
- Prevention, C. f. D. C. a. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2009).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).
- Alstergren, P., et al. Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44. Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6 (12), 21 (2005).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).
- Zhang, J. G., et al. Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy. J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).
