三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

3次元（3D）文化1. HNSC分化注：以前の出版物2に記載された倫理的に承認組織から、たhNSCを分離して導き出す。この手順に従いながら、倫理的、制度的なガイドラインに従ってください。 1.1）3D培養は、12ウェルプレートを使用して、 作業中は無菌技術を使用してください。生物学的安全キャビネットの中で、70％エタノールを2ml /ウェルを添加することにより再水和足場は、灌漑（WFIr）のために水を用いて調製。各ウェルの壁ダウン70％エタノールを分配することによって足場に触れないようにしてください。 慎重に70％エタノールを吸引し、すぐに2ミリリットル/ウェルのDMEMで足場を洗浄する：1分間F12。二回洗浄手順を繰り返します。最終洗浄後にF12：慎重にDMEMを吸引。 F12：DMEM 2 mlのラミニン/ウェル（10μg/ ml）を添加することによりコート足場。 5％のCO 2ハムで37℃でプレートをインキュベート2時間の最低idifiedインキュベーター。暖かいDMEMで洗浄プレート：F12。 RMM +のGF150μlの容積の約50万たhNSCで各足場をシード。 細胞が足場に落ち着くことができるように、5％CO 2加湿インキュベーター中、37℃で3時間静置します。 よく足場から細胞を取り除くしないように注意しながらそれぞれにRMMの3.5ミリリットルを追加します。 7日間プレートをインキュベート。 RMM培地を交換（3.5ミリリットル/ウェル）1日（最初の給餌）の後に、もう一度最初の給餌から2〜3日後。 7日後、培地を除去し、免疫細胞化学（ICC）のために4％パラホルムアルデヒド（PFA）で細胞を固定したり/ウェルの全RNA抽出のための溶解試薬500μlの追加（≤-80℃で保存プレートを、または全RNA抽出に進む） 。 軸索プロセスの伸長の1.2）測定 4％PFAを標準ICCプロトコル20を用いてβに応じた差別たhNSCを固定染色3チューブリン（TUBB3）蛍光色素結合二次抗体を用いて検出した一次抗体。ヘキスト（1μM）との対比染色細胞核。 蛍光顕微鏡を用いてβ3チューブリン染色された細胞の代表的な画像をキャプチャ。 TIFFやJPEGなどの画像を保存します。ソフトウェア測定ツール（ 例えば、イメージ·プロ·プラス）を使用して軸索プロセス伸長の尺度。 、画像を開いて、ツールバーでの測定オプションを選択して、トレース機能を選択します。 トレースを開始するには、マウスボタンをクリックすることにより、軸索伸長上の開始点を選択します。軸索伸長の全長に沿ってトレースする。右の各トレースをクリックして終了します。視野内のすべての軸索outgrowthswithを測定するために繰り返します。 ピクセルまたはミクロン（保留中のキャリブレーション設定する）などの測定値を表す。サンプルの比較や統計分析のためにスプレッドシートプログラムにエクスポート長さの測定。 2. miRNA発現幹細胞を用いたと発生経路集束のmiRNA PCRアレイ 2.1）のmiRNA全RNA抽出足場および2D成長したサンプル（分化し、未分化、hNSCコントロール）上のmiRNA抽出を行う。 必要に応じて、12ウェルプレートに挿入融解足場。同じ1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブ中で2つのウェル、最終体積溶解試薬の1ミリリットルの溶解試薬の内容（500μl）を組み合わせる。ウェルの足場を残すように注意してください。 以前に収集されたとして乾電池をペレット化2D成長したサンプル（差別hNSC 2D培養および未分化制御）のために溶解試薬の1ミリリットルを追加し、1.5 mlのマイクロチューブに内容を転送。 1mlシリンジおよび短い20〜25ゲージ針を用いて各試験サンプルをホモジナイズする。均質な溶解液が達成されるまで、1ミリリットルを5回まで注射器を用いて針を介して溶解液を渡します。 各エッペンドルフチュー​​ブに200μlのクロロホルムを加え、しっかりとキャップ。反転とボルテックスチューブに内容物を混合。 遠心し≥12,000X gで15分間ホモジネートを含む各1.5ミリリットルのマイクロチューブ。 100％エタノール750μlのを含む新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに（すべての相間、ピンク色の液体を移送避ける）各サンプルの上部の水相を転送します。反転により完全に混合。 2 mlのコレクションチューブにミニカラム内に、沈殿物を含む各試験サンプル700μlの、最大ピペット。室温で約30秒間≥8,000×gで蓋と遠心分離機を閉じます。フロースルーを捨てます。サンプルの残りを使用して、この手順を繰り返します。 15分間のDNAダイジェストを実行します。 ≥8,000×gで約30秒間のミニコラムや遠心分離機に700μlのバッファーRWTを追加します。フロースルーを捨てます。 500μlのバッファーRPEを追加し、≥8,000×gで約30秒間遠心分離することにより、ミニカラムを洗浄。フロースルーを捨てます。繰り返しwash.Ce1分間≥12,000×gでntrifugeはさらに、膜を乾燥させる。 ミニカラムにRNaseフリー水を40μlを添加し、≥8,000×gで1分間遠心分離することにより、1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに総RNAを溶出する。適切な分光光度計を用いて全RNA濃度を測定します。 2.2）のmiRNA cDNAを準備逆転写マスターミックスを調製する。各サンプルを5倍miScript混錬バッファー4μlの、10倍nucleicsミックス2μlのを必要とし、2μlを転写酵素ミ​​ックスを逆miScript。 PCRチューブ内のマスターミックスのアリコート8μlの総RNA（250 ng）を所要の体積を追加し、20μlの最終容量にRNaseフリー水を加える。 miScript逆転写酵素ミ​​ックスを不活性化するために95℃で5分間、37℃C.Incubateで60分間インキュベートする。 -20℃で、それぞれ20μlの逆転写反応に店舗を200μlのRNaseフリー水を追加、またはリアルタイムTIを進める私はすぐにPCR。 2.3）幹細胞および発生経路は、miRNA PCRアレイの集束 2X SYBRグリーンマスターミックスの1375μL、100μLのmiRNA cDNA調製、10倍miScriptユニバーサルプライマーの275μlの、およびRNaseフリー水（総容量2,750μl）を1000μlのを追加して15ミリリットルチューブでPCR成分ミックスを調製する。 PCR積載リザーバータンクのPCR成分ミックスを転送します。慎重に密封された袋から、96ウェルプレートのPCRアレイを削除。 8チャンネルピペッター、またはわずか8チップを使用して12チャネルピペッターを使用して、PCRアレイの各ウェルに25μlのPCR成分ミックスを加える。ウェル間の交差汚染を避けるために、各分注ステップ以下のピペットチップを変更します。 気泡を除去するために室温（15~25℃）で、光学接着フィルムでプレートを密封し、1,000×gで1分間遠心する。視覚気泡ウェル中に存在しないことを確認するための下からプレートを検査。 リアルタイムサイクラーで96ウェルプレートのPCR配列を配置します。 プログラムは、それに応じてリアルタイムサーマルサイクラー：10分、および95℃で15秒間の45サイクル、および60℃で1分間、95℃で1サイクルは、単一の（蛍光データ収集）を設定する。 PCRアレイデータ分析テンプレートExcelおよびWebベースのソフトウェアで使用するための空白のExcelスプレッドシートにすべてのウェルのCt値をエクスポートします。 注：ソフトウェアがで入手可能ですwww.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php 。 miRNAのターゲット予測とレポータープラスミドトランスフェクションおよびDdualルシフェラーゼアッセイによる標的mRNAの検証のための3.コンピュータ分析。 3.1）のmiRNAターゲット予測のためのコンピュータ解析 [参照PicTar（ http://pictar.mdc-berlin.de/ ）21、のmiRの識別のためのオンラインで利用可能なアルゴリズムNAは、予測のmRNAをターゲットにしています。 「脊椎動物でPicTar予測のためにはこちらをクリック」をクリックします。新しいページが開きます。 新しいページ、PicTarのWebインターフェイスでは、ドロップダウンメニューで種を選択し、miRNAのID]ボックスに関心のmiRNAを挿入します。 miRNAのターゲットのための検索]をクリックします。 aPicTarスコア順標的mRNAのリストを確認します。 注：PicTarが与えられたUTRは、選択したmiRNAの標的とし、種子の相補性、熱力学と共発現されたmiRNA 22のセットの中で共通の目標のためのコンビナトリアル予測に基づいてされる可能性を反映したスコアを計算します。 同様にDIANA-LAB（使用して標的mRNAのリストを取得http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/ ）23、及びTargetScan（ http://www.targetscan.org/利用可能な回線上）24、代替案をアルゴリズム。 Mの比較表をコンパイルしますのiRNA異なるソフトウェアツールを使用して得られた順位に基づい。 PicTarは終わっ保全、種子の相補性に基づいて集計PCT（、結合の熱力学的自由エネルギーによって（信号対雑音比と予測された結果の重要性を評価するための精密なスコアに信号に基づく）精度によって、スコアによってDianaLabをランク付けし、TargetScan異なる種）は、 表1を参照のこと。 レポータープラスミドトランスフェクションおよびデュアルルシフェラーゼアッセイによる標的mRNAの3.2）の検証。 注：ターゲットmRNAの検証のための3 'UTRルシフェラーゼレポーターは、以前に25を説明してきた。 トランスフェクション /ウェルで24ウェルプレート中に10 5細胞の密度でシードHeLa細胞。 トランスフェクション試薬とNR4A3 3 'UTRor SOX5 3' UTRプラスミド100ngのいずれかの1.5μlのと同様に、20 nMのmiRNAを模倣（SOX5 3用HSA-のmiR-96-5pと24時間、共同トランスフェクトしたHeLa細胞の後217。ウェルあたりUTR、およびHSA-MIR-7-5p、それぞれNR4A3 3 'UTRのためのHSA-MIR-17-5p）。 NR4A3 3 'UTRor SOX5 3' UTRplasmidと蛍光色素ラベルネガティブコントロールsiRNAとの共トランスフェクト対照ウェル。蛍光標識されたネガティブコントロールsiRNA対照ウェルのトランスフェクションは、トランスフェクション効率の評価を可能にし、模倣のmiRNA 3'UTR結合特異性を占める。 デュアルルシフェラーゼ活性の測定ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を24時間後にトランスフェクションを測定します。細胞増殖培地を除去します。 私は、溶液Iの10ミリリットルに50μlの基質を添加することにより、作業溶液を準備。完全に混合する。私は、各ウェル24内にワーキング溶液を300μlを追加します。 96白いプレートの3ウェル、100μlのそれぞれに各24の内容を転送します。 10分待ってから、発光取得のためのルミノメーターセットでホタルルシフェラーゼを測定する。 作業solutを準備イオンII溶液IIの10ミリリットルに基板IIの50μlのを追加することで、完全に混合する。私はすでに作業溶液Iの100μlのを含む各96ウェルに作業溶液100μlのを追加します。 10分待ってから、発光取得のためのルミノメーターセットでウミシイタケルシフェラーゼを測定する。ウミシイタケルシフェラーゼのホタルルシフェラーゼからの発光の比率を計算します。