التمايز من العصبية البشرية خط الخلايا الجذعية على الثقافات الثلاث الأبعاد، تحليل الجينات الرنا الميكروي، واعتبارا الهدف
Summary
With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.
Abstract
الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) قادرة على تجديد الذات والتمايز في الخلايا العصبية، الخلايا النجمية و oligodendrocytes تحت microenvironments محلية محددة. هنا، نقدم مجموعة من الأساليب المستخدمة لثلاثي الأبعاد (3D) التمايز وتحليل ميرنا من الخلايا الجذعية العصبية البشرية (hNSC) خط نسيلي، حاليا في التجارب السريرية للسكتة الدماغية العجز (NCT01151124 وNCT02117635، Clinicaltrials.gov). وقد استمدت HNSCs من وافق الأشهر الثلاثة الأولى القشرة الجنين الإنسان الأخلاقية وخلد مشروط باستخدام التكامل فيروسات من نسخة واحدة من ج-mycER TAM بناء. نحن تصف كيفية قياس عملية محور عصبي ثمرة hNSCs متباينة على السقالات 3D وكيفية قياس التغيرات المرتبطة بها في التعبير ميرنا باستخدام PCR مجموعة. وعلاوة على ذلك نحن مثالا التحليل الحسابي بهدف اختيار ميرنا الأهداف المفترضة. وقد تم تحديد SOX5 وNR4A3 كهدف المفترضة ميرنا مناسبة المحدد بشكل كبير أسفل تنظيمmiRNAs التطوير في hNSC متباينة. تم إجراء ميرنا التحقق من صحة الهدف على SOX5 وNR4A3 3'UTRs التي كتبها المزدوج ترنسفكأيشن مراسل البلازميد والمزدوجة luciferase المراسل الفحص.
Introduction
أبحاث الخلايا الجذعية يلعب دورا مركزيا في الطب التجديدي، الذي يمتد أيضا تخصصات هندسة الأنسجة، بيولوجيا الخلايا في النمو، والعلاجات الخلوية، والعلاج الجيني، والمواد الحيوية (السقالات والمصفوفات). والخلايا الجذعية هي مهمة في كل من هيئة إصلاح الأنسجة للتنمية المشتركة. فهم كيفية عمل الخلايا الجذعية هي محوريا لتطوير العلاج بالخلايا الجذعية الجديدة القائمة 1. CTX0E03 هو نسيلي، الخلايا الجذعية العصبية البشرية خلد مشروط (hNSC) خط 2 معزولة عن الأشهر الثلاثة الأولى القشرة الجنين الإنسان. وقد حددت CTX0E03 خصائص الجودة التي لا غنى عنها للأعمال المصرفية خلية السريري تحت الممارسات التصنيعية الجيدة (GMP) 3. يمكن HNSCs التفريق بصورة عفوية إلى الخلايا العصبية، الدبقية، و oligodendrocytes ولقد ثبت لتحسين العجز العصبية عند زرعها في نموذج القوارض من البؤري نقص التروية 2،4،5. وCTX0E03 hNSCs حاليا في التجارب السريرية للسكتة الدماغية disabilإيتي (NCT01151124 6 و NCT02117635، Clinicaltrials.gov).
MiRNAs لديها متوسط 22 النيوكليوتيدات في الطول وثبت الجزيئات التنظيمية 7، فإنها لا ترميز البروتينات، وإنما ربط 3 المنطقة غير مترجمة الأولى (3'UTR) من من mRNAs، وتنظيم استقرارها وترجمتها إلى بروتينات. وتفيد التقارير MiRNAs للمشاركة في تنظيم عدد من العمليات الخلوية، بما في ذلك تطوير وانتشار الأسلحة، والتمايز 8. قد تورطت عدة miRNAs في تنظيم مصير ومواصفات من الخلايا الجذعية العصبية 9.
في اثنين من الأبعاد (2D) بيئة ثقافة القياسية لم يتم تطابق تعقيد البيئة في الجسم الحي، وبالتالي تحريض وتنظيم hNSC التمايز ليس الأمثل. في الجسم الحي، وتحاط الخلايا من الأبعاد (3D) المكروية ثلاثة ألحان الآخر الخلايا ويغاندس خارج الخلية، بما في ذلك العديدأنواع الكولاجين، laminin، والبروتينات المصفوفة الأخرى (المصفوفة خارج الخلية، ECM). وأفادت دراسات سابقة أن تضاريس المعماري من المواد محاكاة موبينيل والنفوذ الهندسة خلية النمط الظاهري ومصير 10-15. يتوفر عدد من السقالات 3D المتاحة تجاريا. كنا سقالة البوليسترين المسامية العالية هندسيا مع بنية محددة جيدا وموحدة في غشاء سميك 200 ميكرون والتي توفر مساحة 3D في الخلايا التي يمكن أن تغزو وتفرق 16-18.
وتستخدم هذه الوثيقة 2D و 3D المقايسات التمايز لتقييم axonprocess ثمرة. وعلاوة على ذلك، نحن تصف طريقة لمحة عن التعبير ميرنا من خط الصف hNSC السريري لمواصلة التحقيق آثار ميرنا على التمييز بينه و. وتستند هذه الأساليب في هنا يتضح على تلك المذكورة أصلا في 19.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد قدمت تطوير جديد في فحوصات المختبر لتقييم وتحسين تمايز الخلايا الجذعية دائما تحديا للتحقيق في وظائف وقدراتها العلاجية. على المدى الطويل ومرفق مستقر للhNSCs، اللازمة لتطوير 3D قوية التمايز في المختبر فحص، وقد وجهت عن طريق اختبار عدة ركائز 3D مع خصائص مختلفة من حيث المواد والهياكل. كجزء من تطوير فحص نحن أيضا تقييم الأمثل تركيز البذر الخلية وتحديد متطلبات السقالات أن laminin المغلفة. على الرغم من أن لدينا hNSCs يمكن التفريق بشكل عفوي على 4 OHT أظهرت وإزالة عامل النمو، وتنفيذ نظام الثقافة 3D تحسن كبير في القدرة على التمايز التي تقاس محور عصبي عملية ثمرة بالمقارنة مع 2D متباينة hNSCs القياسية.
للتحقيق في تأثير اح 3D يسببهاntiation على hNSC ميرنا التعبير كنا مجموعة PCR. مقارنة مع رقاقة ميكروأري معيار PCR مجموعة تقدم مزايا الكمي المباشر والتحقق من ميرنا من الفائدة. على الرغم من أن مجموعة PCR محدودة في المدى من إجمالي عدد ميرنا لكل صفيف، على سبيل المثال هنا في أقل من 96، فإنه يمكن أن تكون مصممة خصيصا لتشمل miRNAs من الفائدة، في حالتنا ذكرت سابقا في تطوير الخلايا الجذعية. وعرضت لمحة التعبير عن المسار تركز miRNAs في 3D و 2D hNSCs متباينة مقارنة مع hNSCs غير متمايزة. تم تحديد أهمها تنظيم أسفل miRNAs وتحليلها لتقييم من mRNAs الهدف المفترضة مع القصد من تحديد وظائفها والتفسير البيولوجي باستخدام خوارزميات المتاحة على الانترنت (معمل DIANA، PicTar، وTargetScans).
وهناك واحد ميرنا يمكن التعرف على مئات الأهداف، ولهذا السبب نحن التحقق من صحة التفاعلات ميرنا مع 3 'UTR mRNAsthat قد يكون المرشحين المناسبين فيتنظيم xonal. NR4A3، هدفا للهائل سعيد أنعم-مير-7، ومير 17 عائلة، وهو عضو من المستقبلات النووية الأسرة NR4A التي، اعتمادا على مستوى التعبير، وتشارك في التمايز، والبقاء على قيد الحياة، موت الخلايا المبرمج وتنظيم محور عصبي الحصين توجيه 26. وبالمثل SOX5، هدفا لهائل سعيد أنعم-مير-96، ويقال للسيطرة على تقدم دورة الخلية في الأسلاف العصبية 27 طول محور عصبي 28، والهجرة، والتمايز ما بعد الهجرة، والتوقعات من الخلايا العصبية (29). وقد تم تحديد كل من SOX5 وNR4A3 باعتباره مرنا هدفا مباشرا للهائل سعيد أنعم-مير-96، وهائل سعيد أنعم-مير 7 و 17 على التوالي من قبل المزدوجة المقايسات مراسل luciferase المراسل. luciferase المراسل المزدوج (اليراع وRenilla) يعتمد على اثنين من الجينات مراسل مختلفة في نفس بلازميد ويوفر نظام محسن السماح تطبيع للآثار الناجمة عن ترنسفكأيشن دون المستوى الأمثل والآثار السامة للخلايا مقارنة مع نظام بلازميد luciferase المراسل واحد. كجزء من التنمية فحص لدينا نحن أيضا لدينا الأمثل conditi ترنسفكأيشنإضافات من أجل الحصول على كفاءة عالية.
وprotocolsdescribed هنا يمكن استغلالها لزيادة تحسين وتميز في المختبر hNSC التمايز التي قد beimplemented بروتوكولات intransplantation للدراسات ما قبل السريرية والتطبيقات السريرية في المستقبل.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نعترف جولي Heward لمساعدة في إعداد hNSCs، وLavaniya Thanabalasundaram لدعمها التقني مع هيلا زراعة وترنسفكأيشن.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM:F12 | Invitrogen | 21331-020 | For RMM medium preparation |
| Human Albumin Solution | Baxter health care limited | 1501052 | For RMM medium used at a final concentration of 0.03% |
| Transferrin, Human recombinant | Sigma | T8158 | For RMM medium used at a final concentration of 5 µg/ml |
| Putrescine DiHCl | Sigma | P5780 | For RMM medium used at a final concentration of 16.2 µg/ml |
| Insulin, Human recombinant | Sigma | I9278 | For RMM medium used at a final concentration of 5 µg/ml |
| Progesterone | Sigma | P6149 | For RMM medium used at a final concentration of 60 ng/ml |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-24 | For RMM medium used at a final concentration of 2 mM |
| Sodium Selenite | Sigma | S9133 | For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml |
| bFGF | Peprotech | AF-100-15 | To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml |
| EGF | Peprotech | AF-100-188 | To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml |
| 4-OHT | Sigma | H7904 | To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM |
| Laminin | AMS Biotech | 3400-010-10 | |
| TrypZean/EDTA | Lonza | BE02-034E | |
| Water for irrigation | Baxter Healthcare | UKF7114 | |
| Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20°C) | Invitrogen | R007-100 | |
| Alvetex 12 well plate | Reinnervate Ltd | AVP002 | |
| Ethanol | Merck | 1.00986.1000 | |
| βIII tubulin antibody | Sigma | T8660 | |
| Hoechst | Sigma | B2261 | |
| miRNeasy mini kit | Qiagen | 217004 | |
| RNase free DNase | Qiagen | 79254 | |
| Chloroform | Sigma | C7559-5VL | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218160 | |
| SYBR green PCR kit | Qiagen | 218073 | |
| Cell Development & Differentiation miScript miRNA PCR Array | Qiagen/ SABiosciences | MIHS-103Z | |
| Lightcycler 480 white 96 plate | Roche | 4729692001 | |
| Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Vector NR4A3 miRNA 3' UTR target clones | GeneCopeia | HmiT019538-MT0 | |
| Vector SOX5 miRNA 3' UTR target clones | GeneCopeia | HmiT017632-MT01 | |
| Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen). | Qiagen | 1027284 | MiRNA transfection control |
| Luc-Pair miR Luciferase Assay | GeneCopeia | LPFR-M010 | |
| Lightcycler 480 | Roche | ||
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega |
References
- Falanga, V. Stem cells in tissue repair and regeneration. J Invest Dermatol. 132 (6), 1538-1541 (2012).
- Pollock, K., et al. A conditionally immortal clonal stem cell line from human cortical neuroepithelium for the treatment of ischemic stroke. Exp Neurol. 199 (1), 143-155 (2006).
- Hodges, H., et al. Making stem cell lines suitable for transplantation. Cell Transplant. 16 (2), 101-115 (2007).
- Smith, E. J., et al. Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke. Stem Cells. 30 (4), 785-796 (2012).
- Stroemer, P., et al. The neural stem cell line CTX0E03 promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after experimental stroke in a dose-dependent fashion. Neurorehabil Neural Repair. 23 (9), 895-909 (2009).
- Kalladka, D., Muir, K. W. Brain repair: cell therapy in stroke. Stem Cells Cloning. 7, 31-44 (2014).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Anokye-Danso, F., et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).
- Li, X., Jin, P. Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 329-338 (2010).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Semin Cell Dev Biol. 13 (5), 377-383 (2002).
- Buxboim, A., Discher, D. E. Stem cells feel the difference. Nat Methods. 7 (9), 695-697 (2010).
- Li, W. J., et al. A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 26 (6), 599-609 (2005).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
- Ortinau, S., et al. Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells. Biomed Eng Online. 9 (1), 70 (2010).
- Saha, K., Pollock, J. F., Schaffer, D. V., Healy, K. E. Designing synthetic materials to control stem cell phenotype. Curr Opin Chem Biol. 11 (4), 381-387 (1016).
- Knight, E., Murray, B., Carnachan, R., Przyborski, S. Alvetex(R): polystyrene scaffold technology for routine three dimensional cell culture. Methods Mol Biol. 695, 323-340 (2011).
- Bokhari, M., Carnachan, R. J., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. Emulsion- templated porous polymers as scaffolds for three dimensional cell culture: effect of synthesis parameters on scaffold formation and homogenity. J. Mater. Chem. 17, 4088-4094 (2007).
- Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function. Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).
- Stevanato, L., Sinden, J. D. The effects of microRNAs on human neural stem cell differentiation in two- and three-dimensional cultures. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 49 (2014).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
- Chen, K., Rajewsky, N. Natural selection on human microRNA binding sites inferred from SNP data. Nat Genet. 38 (12), 1452-1456 (2006).
- Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).
- Maragkakis, M., et al. Accurate microRNA target prediction correlates with protein repression levels. BMC Bioinformatics. 10, 295 (2009).
- Lewis, B. P., Burge, C. B., Bartel, D. P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell. 120 (1), 15-20 (2005).
- Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. Identifying targets of human micrornas with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3’UTR-reporter constructs and a microRNA mimic in adherent cells. J Vis Exp. (55), (2011).
- Ponnio, T., Conneely, O. M. nor-1 regulates hippocampal axon guidance, pyramidal cell survival, and seizure susceptibility. Mol Cell Biol. 24 (20), 9070-9078 (2004).
- Martinez-Morales, P. L., Quiroga, A. C., Barbas, J. A., Morales, A. V. SOX5 controls cell cycle progression in neural progenitors by interfering with the WNT-beta-catenin pathway. EMBO Rep. 11 (6), 466-472 (2010).
- Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 16021-16026 (2008).
- Lai, T., et al. SOX5 controls the sequential generation of distinct corticofugal neuron subtypes. Neuron. 57 (2), 232-247 (2008).
