Avaliação não invasiva da eficácia de novos Therapeutics para Intestinal Patologias Usando imagem endoscópica série da Vivo Ratos
Summary
We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.
Abstract
Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.
Introduction
O câncer colorretal (CCR) é a 4ª causa mais comum de tumor maligno em todo o mundo 1. Apesar dos progressos significativos em nossa compreensão da base familiar desta doença, a predisposição genética contribui apenas para ~ 20% dos casos 2 CRC. O restante é atribuído a vários fatores extrínsecos e ambientais, incluindo a inflamação crônica. Nos seres humanos, a ligação entre a inflamação crónica e o cancro do cólon é evidente em colite ulcerosa (UC) pacientes, que têm um maior risco de desenvolvimento de cancro do cólon associada à colite (CAC), dependendo da duração, amplitude e da gravidade da doença inflamatória 3 -5. Consequentemente, novas terapias estão em desenvolvimento para controlar a resposta imunitária e a produção de factores de crescimento associados factores pelo microambiente tumoral inflamatório 6-8. Existe uma exigência crescente de modelos animais pré-clínicos apropriados para caracterizar a eficácia terapêutica deestas drogas contra o desenvolvimento e progressão da doença.
Modelos de ratos têm inequivocamente demonstrado que o microambiente inflamatório contribui para a progressão da CRC, mesmo na ausência de inflamação evidente 9,10. Estes modelos incluem a utilização do sulfato de sódio polissacárido dextrano (DSS), fornecido na água de beber dos ratos, para modelar lesão epitelial e doença intestinal inflamatória aguda e crónica (IBD) 11,12. Embora o mecanismo pelo qual DSS induz lesão da mucosa e colite não é completamente compreendido, alguns estudos sugerem que o DSS inibe as actividades de transcriptase reversa e de ribonuclease celulares no interior das células, ou promove a formação de complexos de nano-lipídico que se fundem com a membrana epitelial do cólon levando a danos 13,14. Modificações ao modelo DSS padrão também forneceram uma visão significativa sobre os mecanismos pelos quais as células epiteliais do cólon manter a homeostase do tecido e regularidadetarde respostas imunes nas mucosas 15.
A administração intraperitoneal de Azoximetano (OMA) sozinho, ou em combinação com DSS, fornece um modelo para a análise da interacção entre as mutações somáticas na mucosa epitelial e estromal no microambiente inflamatório e 16,17. OMA é um metabólito da substância cancerígena 1,2-dimetil-hidrazina (DMH), que não resultam diretamente em mutações no DNA. Em vez disso, a AOM é hidrolisado para methylazoxymethanol (MAM) pela isoforma do citocromo CYP2E1 no fígado, onde MAM é conjugado com o ácido glucorónico e, em seguida, transportados para o intestino através de secreções biliares 18. Pensa-se que o β-glucuronidase bacteriana contribui para a degradação do MAM resultando na alquilação de DNA e a acumulação de mutações em células epiteliais 19. A maioria dos tumores do cólon induzida por AOM abrigar mutações missense no gene que codifica a β-catenina, tornando a proteína resistente a degradação de proteossomono, o que resulta na activação aberrante da canónica via de sinalização Wnt-20. Quando a atividade da OMA é combinada com a lesão da mucosa provocada por DSS, a ferida que se seguiu a resposta de cura cria um microambiente que é propício para o crescimento e expansão do epitélio mutado. Numa variação deste modelo, a administração repetitiva de OMA sozinho ao longo de um período de várias semanas pode ser usado para modelar o cancro colorectal esporádica, na ausência de colite induzida por DSS 10,17. Estes dois modelos de cortesia fornecer configurações experimentais para estudar as CAC e esporádica CRC, respectivamente, ambas as quais estão associadas com um microambiente tumoral pró-inflamatória 10.
O uso de endoscopia de série em camundongos foi iniciada por Becker e seus colegas 21, e permite o monitoramento longitudinal da colite e progressão tumoral. Aqui nós fornecemos três protocolos pré-clínicos com base em danos na mucosa induzida por DSS e / ou mediada por AOM tumor indução para induzir reproducibly patologias do cólon específicos. O primeiro protocolo descreve induzir danos na mucosa aguda em resposta à administração de DSS para induzir muitas das características histológicas associadas com IBD. O segundo protocolo baseia-se em três ciclos consecutivos de administração DSS para simular as chamas de inflamação normalmente observadas em doentes de IBD, e pode ser levada a cabo em conjunção com mutações induzidas por AOM. O protocolo final é baseado em mutações esporádicas epiteliais induzida pela OMA. Para cada um destes protocolos, vamos expandir sobre os procedimentos padrões relevantes a incluir métodos de intervenção profiláticas e terapêuticas que temos desenvolvido para monitorar a eficácia de novos medicamentos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os três protocolos que são descritos os métodos de contorno de indução confiável e reprodutível da patologia da doença do cólon em camundongos. Quando combinado com as estratégias de intervenção descritas aqui acompanhamento endoscópico de rotina e, estes protocolos irá fornecer poderosa visão pré-clínicos sobre a eficácia da terapêutica. Nossos laboratórios rotineiramente usar todos esses protocolos para monitorar o sucesso de novas terapias 10,23,24.
Há um número de considerações ao escolher um modelo animal pré-clínica para testar novas terapêuticas. Estes incluem a relevância do modelo para a doença humana, e a contribuição do microambiente do tumor para a acção proposta do alvo terapêutico. Aqui nós fornecemos três protocolos de intervenção terapêutica em modelos de doenças intestinais estabelecidos. Estes modelos são reprodutíveis e a entrega de reagentes para induzir a doença é fácil de gerir. É importante ressaltar que os modelos são altamente relevantesde múltiplas facetas e fases de início colite, e de iniciação e progressão tumoral. Os investigadores devem levar em consideração o fundo genético das linhagens de camundongos utilizados na concepção experiências, como a susceptibilidade à doença induzida por DSS e / ou AOM podem variar consideravelmente 25. Além disso, diferentes comunidades microbianas podem ter diferentes capacidades metabólicas no contexto de AOM, a qual é metabolizada pelas bactérias. Advertimos contra o uso de diferentes grupos de ratos que nasceram em diferentes instalações para animais (incluindo fornecedores comerciais) em um único experimento. Da mesma forma, o diferente microflora em camundongos usados de diferentes instalações podem provocar diferentes respostas do hospedeiro para DSS-induzida danos barreira epitelial 11. Além disso, a análise de tecido apropriado (por exemplo, a purificação de ARN) também deve ser considerado, uma vez que a capacidade de DSS a inibir a transcriptase reversa terá um impacto sobre a análise molecular subsequente 26,27.
<p class = "jove_content"> Mouse endoscopia é uma técnica de ponta para monitorar constantemente o início da doença e progressão em um mouse individual. A capacidade de gravar vídeos e extrair imagens ainda permite fácil monitoramento de vários parâmetros de doenças e tumores. Além de melhorar o bem-estar animal, a monitorização endoscópica também reduz a necessidade de vários grupos de camundongos experimentais, que tradicionalmente foram abatidos em diferentes pontos de tempo para acompanhar a evolução da doença. O sistema de pontuação MEICS não é um substituto para a análise histopatológica, mas fornece um meio alternativo para monitorar danos a saúde animal e da mucosa em camundongos vivos. Rato endoscopia é uma técnica de laboratório especializado, e todos os procedimentos devem ser realizados por pessoal treinado para garantir a manipulação e manejo adequado dos camundongos, bem como para proporcionar qualidade consistente nas imagens usadas para marcar doença. Nas mãos de pessoal qualificado, descobrimos que a endoscopia induz pouco ou nenhum dano para o tumors que poderiam causar hemorragia intra-tumoral. Para os protocolos terapêuticos esboçados, consideramos endoscopia altamente vantajoso, uma vez que fornece uma maneira de determinar a carga do tumor inicial, e nos permite coortes grupo de animais com tumor encargos semelhantes antes da administração de uma droga terapêutica. Monitoramento seqüencial da camundongos permite aos pesquisadores determinar a eficácia de novas terapias no início, com a opção de terminar de experiências sem sucesso em tempo hábil.Como nossa compreensão da doença inflamatória intestinal e colorectal cânceres antecedência, novos alvos para a terapia será identificado. Modelos animais apropriados fará parte integrante de garantir que as novas terapias mais promissoras são movidos em direção ensaios clínicos.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank CSL Ltd. for supporting the purchase of the endoscopy equipment. The research in the laboratory of ME is supported by the Ludwig Institute for Cancer Research, and the laboratories of TP and ME are supported by the Victorian State Government Operational Infrastructure Support and the National Health and Medical Research Council of Australia. ME is an NHMRC Senior Research Fellow.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dextran Sulfate Sodium (MW 36,000-50,000) | MP Biochemicals | 160110 | Requires batch testing. |
| Azoxymethane | Sigma | A5486-100MG | Requires batch testing. |
| Vanilla Protein Shake | N/A | N/A | Available from hospital pharmacies. |
| Isoflourane | PPC | M60303 | This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | Standard lab reagent. |
| Coloview miniendoscopic system | |||
| Endovision Tricam | Karl Storz | 20212001-020 | |
| Xenon 175 light source with anti-fog pump | Karl Storz | 20134001 | |
| HOPKINS straight Forward Telescope | Karl Storz | 64301AA | |
| Endoscopic Sheath (total diameter 3 mm) | Kalr Stroz | 61029C | |
| Fubre Optic Light Cable | Kalr Stroz | 69495ND | |
| Computer and media player software | MAC, imovies | ||
| Scale | Any | Any scale suitable for weighing mice. |
References
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