تقييم غير الغازية من فعالية العلاجات الجديدة لعلوم الأمراض المعوية عن طريق التصوير بالمنظار المسلسل من الفئران الحية
Summary
We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.
Abstract
Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.
Introduction
سرطان القولون والمستقيم (CRC) هو 4 تشرين السبب الأكثر شيوعا من الأورام الخبيثة في جميع أنحاء العالم 1. وعلى الرغم من إحراز تقدم كبير في فهمنا للأساس عائلي من هذا المرض، والاستعداد الوراثي يساهم فقط ل~ 20٪ من الحالات CRC 2. وتعزى الباقي إلى العديد من العوامل الخارجية والبيئية، بما في ذلك التهاب مزمن. في البشر، والصلة بين الالتهاب المزمن وسرطان القولون هو واضح في التهاب القولون التقرحي (UC) من المرضى، الذين لديهم خطر أكبر للإصابة بسرطان القولون والتهاب القولون المرتبط (CAC)، وهذا يتوقف على مدة ومدى وشدة المرض الالتهابي 3 -5. وفقا لذلك، علاجات جديدة هي في التنمية للسيطرة على الاستجابة المناعية وإنتاج يرتبط النمو وتعزيز عوامل من الورم المكروية التهابات 6-8. وهناك شرط المتزايد على النماذج الحيوانية ما قبل السريرية المناسبة لوصف الكفاءة العلاجية للهذه الأدوية ضد تطور وتقدم المرض.
وقد أظهرت نماذج الماوس بشكل لا لبس فيه أن المكروية التهابات تساهم في CRC التقدم، حتى في حالة عدم وجود التهاب العلني 9،10. وتشمل هذه النماذج استخدام الصوديوم السكاريد ديكستران كبريتات (DSS)، المنصوص عليها في مياه الشرب من الفئران، لنموذج إصابة الظهارية ومرض التهاب الأمعاء الحاد والمزمن (IBD) 11،12. على الرغم من أن الآلية التي DSS يدفع الضرر المخاطية والتهاب القولون ليست مفهومة تماما، وتشير بعض الدراسات إلى أن DSS يمنع الأنشطة الناسخ وريبونوكلياز عكس الخلوية داخل الخلايا، أو تشجع على تشكيل مجمعات للنانو الدهون التي تلتحم مع غشاء القولون يؤدي إلى الضرر الظهارية 13،14. وقد وفرت تعديلات على نموذج DSS القياسية أيضا نظرة كبيرة في الآليات التي الخلايا الظهارية القولون الحفاظ على توازن الأنسجة وreguأواخر الاستجابات المناعية المخاطية 15.
داخل الصفاق إدارة Azoxymethane (AOM) وحده، أو بالاشتراك مع مفاجآت صيف دبي، ويقدم نموذجا لدراسة التفاعل بين الطفرات الجسدية في الغشاء المخاطي الظهارية والتهابات وانسجة المكروية 16،17. AOM هو المستقلب من مادة مسرطنة 1،2-dimethylhydrazine (DMH) أن لا يؤدي بشكل مباشر في طفرات الحمض النووي. بدلا من ذلك، AOM هو تحلل لmethylazoxymethanol (MAM) من خلال شكل الإسوي السيتوكروم CYP2E1 في الكبد، حيث يتم مترافق MAM مع حمض الغلوكورونيك ومن ثم نقلها إلى الأمعاء عن طريق الإفرازات الصفراوية 18. ويعتقد أن البكتيريا β غلوكورونيداز يساهم في تدهور MAM مما أدى إلى الألكلة DNA وتراكم الطفرات في الخلايا الظهارية 19. معظم أورام القولون الناجم عن AOM تؤوي الطفرات مغلطة في ترميز الجين β-كاتينين، مما يجعل البروتين مقاومة للdegradati proteasomalعلى، مما يؤدي إلى تنشيط الشاذة من الكنسي مسار WNT-يشير 20. عندما يتم الجمع بين نشاط AOM مع الضرر المخاطية التي تسببها DSS، الجرح الشفاء التي تلت ذلك استجابة يخلق المكروية مواتية لنمو والتوسع في ظهارة mutagenized. في الاختلاف من هذا النموذج، والإدارة المتكررة من AOM وحدها على مدى عدة أسابيع يمكن استخدامها لنموذج سرطان القولون والمستقيم متفرقة، في غياب الناجم عن التهاب القولون DSS 10،17. وتوفر هذه نموذجين مجانية إعدادات التجريبية لدراسة CAC ومتفرقة CRC على التوالي، وكلاهما يرتبط مع ورم المكروية الموالية للالتهابات 10.
وقد رائدة في استخدام التنظير التسلسلي في الفئران عن طريق بيكر وزملاؤه 21، وتمكن الرصد الطولي للالتهاب القولون وتطور الورم. هنا نقدم ثلاثة بروتوكولات ما قبل السريرية على أساس الضرر الناجم عن DSS المخاطية و / أو بوساطة AOM تومور تحريض للحث على بتكاثر أمراض القولون محددة. يصف البروتوكول الأول حمل الضرر المخاطية الحاد ردا على إدارة DSS لانتزاع العديد من المظاهر التشريحية المرضية المرتبطة IBD. ويستند البروتوكول الثاني على ثلاث دورات متتالية من إدارة DSS لتقليد مشاعل من التهاب احظ عادة في المرضى IBD، ويمكن أن تنفذ بالتزامن مع الطفرات التي يسببها AOM. ويستند البروتوكول النهائي على الناجمة عن الطفرات AOM الظهارية متفرقة. لكل من هذه البروتوكولات، ونوسع على الإجراءات القياسية ذات الصلة لتشمل طرق التدخل الوقائية والعلاجية التي قمنا بتطويرها لمراقبة فعالية الأدوية الجديدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكولات الثلاثة التي تم وصفها أساليب الخطوط العريضة للتحريض موثوقة وقابلة للتكرار علم الأمراض مرض القولون في الفئران. عندما يقترن مراقبة بالمنظار الروتيني واستراتيجيات التدخل المذكورة هنا، فإن هذه البروتوكولات توفير نظرة ما قبل السريرية قوية في فعالية العلاجات. مختبراتنا بشكل روتيني استخدام كل من هذه البروتوكولات لمراقبة نجاح علاجات جديدة 10،23،24.
وهناك عدد من الاعتبارات عند اختيار نموذج حيواني ما قبل السريرية لاختبار علاجات جديدة. وتشمل هذه أهمية النموذج إلى الأمراض التي تصيب البشر، ومساهمة المكروية الورم إلى العمل المقترحة من الهدف العلاجي. هنا نقدم ثلاثة بروتوكولات للتدخل العلاجي في إنشاء نماذج مرض الأمعاء. هذه النماذج هي استنساخه وتسليم الكواشف للحث على المرض من السهل السيطرة عليها. الأهم من ذلك أن النماذج هي ذات أهمية كبيرة لجوانب ومراحل التهاب القولون البداية، وبدء الورم والتقدم متعددة. يجب على الباحثين أن تأخذ في الاعتبار الخلفية الوراثية للسلالات الماوس تستخدم عند تصميم التجارب، حيث أن الاستعداد للإصابة بالأمراض الناجمة عن DSS و / أو AOM يمكن أن تختلف إلى حد كبير 25. وبالإضافة إلى ذلك، قد يكون المجتمعات الميكروبية المختلفة القدرات الأيضية المختلفة في سياق AOM، والتي يتم استقلاب من البكتيريا. ونحن نحذر من استخدام الأفواج مختلفة من الفئران التي ولدت في مرافق حيوانية مختلفة (بما في ذلك الباعة التجارية) في تجربة واحدة. وبالمثل، فإن الدقيقة المختلفة في الفئران المستخدمة من المرافق المختلفة قد يؤدي إلى استجابات المضيف مختلفة لمفاجآت صيف دبي التي يسببها الضرر الحاجز الظهاري 11. وعلاوة على ذلك، ينبغي النظر أيضا في التحليل المناسب للأنسجة (لتنقية المثال RNA)، منذ قدرة DSS لمنع الناسخ العكسي سيؤثر على التحليل الجزيئي لاحق 26،27.
<p claق ق = "jove_content"> ماوس التنظير هو تقنية المتطورة لمراقبة مرارا وتكرارا بداية ظهور أعراض المرض والتقدم في الماوس الفردية. القدرة على تسجيل الفيديو واستخراج الصور الثابتة تسمح رصد سهل من المعلمات المرض متعددة والأورام. وبالإضافة إلى تحسين رعاية الحيوان، ورصد بالمنظار يقلل أيضا الحاجة إلى الأفواج متعددة من فئران التجارب، التي أعدمت تقليديا على مختلف نقاط الوقت لتتبع نتائج المرض. نظام التسجيل MEICS ليس بديلا للتحليل الأنسجة، ولكن يوفر بديلا يعني لمراقبة صحة الحيوان والغشاء المخاطي الضرر في الفئران الحية. الماوس التنظير هو تقنية المختبرات المتخصصة، ويجب أن يتم تنفيذ كافة الإجراءات من قبل الأفراد المدربين لكفالة التلاعب والتعامل المناسب من الفئران، وكذلك لتوفير جودة ثابتة في الصور المستخدمة لتسجيل المرض. في أيدي الشخصية المؤهلة، وجدنا أن التنظير يدفع الضرر ضئيلة أو معدومة للtumoRS التي من شأنها أن تسبب نزيف داخل ورمي. البروتوكولات العلاجية المذكورة، ونحن نعتبر التنظير المفيد للغاية، نظرا لأنه يوفر وسيلة لتحديد عبء الورم الأولي، ويسمح لنا الأفواج مجموعة من الحيوانات مع أعباء الورم مماثلة قبل إدارة الدواء العلاجية. مراقبة متتابعة من الفئران تمكن الباحثين من تحديد مدى فعالية علاجات جديدة في وقت مبكر، مع خيار لإنهاء التجارب غير الناجحة في الوقت المناسب.كما فهمنا من مرض التهاب الأمعاء وسرطان القولون والمستقيم مسبقا، وسيتم تحديد أهداف جديدة للعلاج. سوف نماذج حيوانية مناسبة أن يكون جزءا لا يتجزأ من التأكد من أن العلاجات الجديدة الواعدة يتم نقل نحو التجارب السريرية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank CSL Ltd. for supporting the purchase of the endoscopy equipment. The research in the laboratory of ME is supported by the Ludwig Institute for Cancer Research, and the laboratories of TP and ME are supported by the Victorian State Government Operational Infrastructure Support and the National Health and Medical Research Council of Australia. ME is an NHMRC Senior Research Fellow.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dextran Sulfate Sodium (MW 36,000-50,000) | MP Biochemicals | 160110 | Requires batch testing. |
| Azoxymethane | Sigma | A5486-100MG | Requires batch testing. |
| Vanilla Protein Shake | N/A | N/A | Available from hospital pharmacies. |
| Isoflourane | PPC | M60303 | This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | Standard lab reagent. |
| Coloview miniendoscopic system | |||
| Endovision Tricam | Karl Storz | 20212001-020 | |
| Xenon 175 light source with anti-fog pump | Karl Storz | 20134001 | |
| HOPKINS straight Forward Telescope | Karl Storz | 64301AA | |
| Endoscopic Sheath (total diameter 3 mm) | Kalr Stroz | 61029C | |
| Fubre Optic Light Cable | Kalr Stroz | 69495ND | |
| Computer and media player software | MAC, imovies | ||
| Scale | Any | Any scale suitable for weighing mice. |
References
- Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10, 353-358 (2009).
- Rustgi, A. K. The genetics of hereditary colon cancer. Genes Dev. 21, 2525-2538 (2007).
- Rutter, M., et al. Severity of inflammation is a risk factor for colorectal neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 126, 451-459 (2004).
- Eaden, J. A., Abrams, K. R., Mayberry, J. F. The risk of colorectal cancer in ulcerative colitis: a meta-analysis. Gut. 48, 526-535 (2001).
- Lakatos, P. L., Lakatos, L. Risk for colorectal cancer in ulcerative colitis: changes, causes and management strategies. World J Gastroenterol. 14, 3937-3947 (2008).
- Xiang, B., Snook, A. E., Magee, M. S., Waldman, S. A. Colorectal cancer immunotherapy. Discov Med. 15, 301-308 (2013).
- Feng, Q. Y., et al. Anti-EGFR and anti-VEGF agents: Important targeted therapies of colorectal liver metastases. World J Gastroenterol. 20, 4263-4275 (2014).
- Dinarello, C. A. Anti-inflammatory Agents: Present and Future. Cell. 140, 935-950 (2010).
- Grivennikov, S. I., et al. Adenoma-linked barrier defects and microbial products drive IL-23/IL-17-mediated tumour growth. Nature. 491, 254-258 (2012).
- Putoczki, T., Thiem, S., Loving, A., Busuttil, R. A., Wilson, N. A., Ziegler, P., Nguyen, P., Preaudet, A., Farid, R., Edwards, K., Boglev, Y., Luwor, R. B., Jarnicki, A. J., Horst, D., Boussioutas, A., Heath, J., Sieber, O., Nash, A., Greten, F., McKenzie, B. S., Ernst, M. Interleukin-11 is the dominant IL-6 family cytokine during gastrointestinal tumorigenesis and can be targeted therapeutically. Cancer Cell. 24, 257-271 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
- Rose, W. A., Sakamoto, K., Leifer, C. A. Multifunctional role of dextran sulfate sodium for in vivo modeling of intestinal diseases. BMC Immunol. 13, 41 (2012).
- Laroui, H., et al. Dextran sodium sulfate (DSS) induces colitis in mice by forming nano-lipocomplexes with medium-chain-length fatty acids in the colon. PLoS One. 7, e32084 (2012).
- Miyazawa, F., Olijnyk, O. R., Tilley, C. J., Tamaoki, T. Interactions between dextran sulfate and Escherichia coli ribosomes. Biochim Biophys Acta. 145, 96-104 (1967).
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14, 141-153 (2014).
- Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nat Protoc. 2, 1998-2004 (2007).
- Schwitalla, S., et al. Loss of p53 in Enterocytes Generates an Inflammatory Microenvironment Enabling Invasion and Lymph Node Metastasis of Carcinogen-Induced Colorectal Tumors. Cancer Cell. 23, 93-106 (2013).
- Fiala, E. S. Investigations into the metabolism and mode of action of the colon carcinogens 1,2-dimethylhydrazine and azoxymethane. 40, 2436-2445 (1977).
- Chen, J., Huang, X. F. The signal pathways in azoxymethane-induced colon cancer and preventive implications. Cancer Biol Ther. 8, 1313-1317 (2009).
- Bollrath, J., et al. gp130-mediated Stat3 activation in enterocytes regulates cell survival and cell-cycle progression during colitis-associated tumorigenesis. Cancer Cell. 15, 91-102 (2009).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1, 2900-2904 (2006).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139, 485-498 (2009).
- Thiem, S., et al. mTORC1 inhibition restricts inflammation-associated gastrointestinal tumorigenesis in mice. J Clin Invest. 123, 767-781 (2013).
- Stuart, E., et al. Therapeutic inhibition of Jak activity inhibits progression of gastrointestinal tumors in mice. Mol Cancer Ther. 13, 468-474 (2014).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9 (2011).
- Viennois, E., Chen, F., Laroui, H., Baker, M. T., Merlin, D. Dextran sodium sulfate inhibits the activities of both polymerase and reverse transcriptase: lithium chloride purification, a rapid and efficient technique to purify RNA. BMC Res Notes. 6, 350 (2013).
- Kerr, T. A., et al. Dextran sodium sulfate inhibition of real-time polymerase chain reaction amplification: a poly-A purification solution. Inflamm Bowel Dis. 18, 344-348 (2012).
