개인 오물 파리에서 인성 세균 병원균의 검출

파리의 1. 컬렉션 멸균 곤충학 스윕 그물을 사용하여 개별 파리를 수집합니다. 쿨러에 그물을 넣어 실험실로 전송. 파리의 2 해부 7 분 – 5 -20 ° C에서 그들을 배치하여 무균 수집 파리를 고정. 예열 된 (37 ° C) 완충 펩톤 수 (BPW) 1 ㎖를 함유하는 2 ml의 멸균 튜브에 무균 핀셋을 도시 한 플라이 사용. 2 분 동안 반전에 의해 부드럽게 튜브를 섞는다. 이는 비행의 신체 표면 (S) 상에 존재하는 미생물은 BPW (BPW-S)로 전송 될 수 있도록 비행 전신 매체와 접촉하는 것이 필수적이다. 파리의 수와 신체 부분 (즉, 1S)와 튜브 레이블. 참고 :이 프로토콜에 언급 된 재료 및 시약에 대한 자세한 설명은 특정 시약 / 장비의 표를 참조하십시오. 멸균 집게를 사용하면 BPW-S 미디어 및 전송에서 즉시 제거빈 깨끗한 2 ML 튜브에는 즉시 소독 표면에. 소독 및 절개 프로토콜을 수행하는 동안 37 ° C에서 BPW-S를 함유하는 매체를 튜브 인큐베이션. 갓 준비한 0.05 % (v / v)의 표백 액 1ml에 침지 전에 멸균 증류수로 린스 1 분간 70 % 에탄올 1 ㎖, 그것을 침지 플라이 표면 – 소독. 멸균 증류수로 3 회 씻어. 멸균이 ML 튜브에 마지막 헹굼 물을 전송합니다. 참고 : 1,000 μL 마이크로 피펫을 사용하거나, 튜브를 반전 비행 튜브 내부에 남아 있는지 확인하여 액체마다 폐기하십시오. 표면 소독 공정의 각 단계에서 반전하여 부드럽게 섞는다. 상기 살균 공정의 효율성을 평가 트립 토스 대두 한천 (TSA) 플레이트에서 마지막 헹굼 물 100 μl를 전송하고 멸균 L 자형 일회용 균태 확산. 24 시간 동안 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션. 의 후cubation, 어떤 세균 식민지의 존재를 등록합니다. 주 : TSA 플레이트에 박테리아 식민지의 존재는 비효율적 인 표면 소독 과정을 나타냅니다. 이 경우 신체 표면 및 소화관 간의 교차 오염을 배제 할 수 없기 때문에, 인성 병원균의 존재는 파리의 신체 표면에보고되어야한다. 비행 표면이-소독 한 후 멸균 60mm 일회용 페트리 접시에 과량의 물을 제거하기 위해 멸균 된 종이 타월의 조각에 전송합니다. 해부 범위에 페트리 접시를 놓고 시류 가족 (20, 21)에 대한 이분법 키를 사용하여 종 수준으로 비행을 식별합니다. 부드럽게 무균 플라이 아웃 항문 전체 소화관 (A)를 당겨 멸균 미세 팁 집게를 사용하여 0.5 mm 지르코니아 / 실리카와 예열 된 (37 ° C) BPW 1 ㎖를 함유하는 다른 살균이 ML 튜브로 전송할 구슬 (BPW-A). 라벨 번째개별 플라이 플라이 (즉 1A)의 몸통 부 선정과 같은 번호 E 튜브. 세포 파쇄 장치를 사용하여 10 분 – 5 철저히 BPW-A를 함유하는 튜브를 섞는다. 프로토콜의 나머지 부분을 수행하는 동안 36 ± 1 ° C에서 품어. 바우처 및 / 또는 장기의 표본을 저장, 깨끗한 2 ML 튜브에 파리의 나머지를 놓고 1 추가 – 95 % 에탄올 2 ㎖를. 3. 기본 및 보조 심화 샘플 수와 파리의 신체 부위에 따라 매체를 포함하는 모든 기본 및 보조 농축 튜브 레이블. 멸균 후드에서 다음 미디어를 포함하는 2 ml의 튜브를 멸균하기 위해 BPW-S (표면)의 300 μl를 전송 : 살모넬라를 들어, 예열 (42 ° C) BPW 1 ㎖를 사용합니다. 24 시간 – 22 42.5 ° C로 재순환 수조에서 인큐베이션. 차 농축를 들어, 400 & #에 풍부한 BPW 100 ㎕를 전송181; 이전에 무균 클러스터 튜브에 넣고 예열 (37 ° C) 뇌 심장 주입 (BHI) 국물의 리터. 3 시간 동안 37 ° C에서 품어. Cronobacter를 들어, novobiocin와 예열 (37 ° C) BPW 1 ㎖ (, 월러스, M., 개인 통신 (10) ㎎ / L)를 사용합니다. 또한, 차 농축 등의 보충 (반코마이신과 cefsulodin)와 R & F 엔테로 박터 sakazakii의 농축 국물 1 ㎖를 사용합니다. 26 시간 – 22 37 ° C에서 품어. 차 농축를 들어, 이전에 멸균 클러스터 튜브에 넣고 예열 (37 ° C) BHI 국물 400 μL에 novobiocin 풍부 BPW의 100 μl를 전송합니다. 3 시간 동안 37 ° C에서 품어. L. 들어 모노 사이토, 선택적 보충 갓 준비 RT 24 리스테리아 농축 국물 (24 LEB) 1 ㎖를 사용합니다. 44 ± 5​​ 시간 동안 37 ° C에서 품어. 어떤 차 농축은 L.의 검출이 필요하지 않습니다 모노 사이토. </li> BPW-A로 표시 튜브를 사용하여 상기 3.2.3 – 반복 3.2.1 단계를 반복합니다. 대상 식품 매개 병원체의 증폭과 검출을위한 PCR 기반 시스템 4. 준비 4-8 살모넬라 균 (살모넬라 균 2 표준 분석 키트), Cronobacter 종 (E. sakazakii의 표준 분석 키트) 및 리스테리아 균을 선별하기 위해 상용 PCR 자전거 타는 사람 / 검출기 시스템, 컴퓨터 워크 스테이션 및 즉시 사용 가능한 키트를 사용 단계 (L. 24E는 분석 키트 모노 사이토 겐). 표준 분석은 PCR 종점 검출을 사용한다. 각 키트는 이중 가닥 DNA에 결합 할 때 형광 신호를 방출하는 인터 염료와 PCR-준비 정제가 포함되어 있습니다. 신호는 포지티브 또는 네거티브로서 소프트웨어에 의해 해석되는 융해 곡선을 생성 PCR 시스템 프로그램의 검출 단계에서 포착된다. manufactu의에 의해 지정된 시약 및 장비를 준비합니다각 대상 인성 병원균 당 총통의 프로토콜입니다. 주 : 살모넬라 Cronobacter를 검출하기위한 프로토콜 L.를 검출 프로토콜 반면 원스텝 용해 과정이 필요 모노 사이토 겐은 두 단계의 분해 과정을 (각각 제 5,6 참조)를 요구한다. 대상 병원체의 특정 프로그램을 선택 자동화 가열 블록을 켭니다. (- 6.2 단계를 참조 L.가 용해의 2 부 모노 사이토 겐)와 가열 블록 수동 경우 또는, (. 살모넬라, Cronobacter 종 및 리스테리아 모노 사이토 겐) 37 ° C 또는 55 ± 2 ° C의 온도를 설정 95 ± 3 ° C의. 적어도 2 시간 동안 8 °의 C – 그렇지 않으면 2에 그들을 진정, 냉각 블록 O / N 냉장되어 있는지 확인합니다. PCR 기반 탐지 시스템의 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 제조사의 지침에 따라 랙 파일을 생성한다. 레이블 및 클러스터를 배치튜브 랙 파일에 따라, 랙의 용해 시약을 함유. PCR 기반 탐지 시스템 기기를 초기화합니다. 5. 살모넬라와 Cronobacter의 탐지를 위해 용해를 수행 용해 완충액의 한 12 ㎖의 병 프로테아제의 150 μl를 첨가하여 용해 시약을 준비한다. 이전에 표시된 클러스터 각 튜브 용균 시약 200 μL를 전송합니다. 참고 : – 최대 2 주 동안 8 ° C에서 용해 시약을 포함하는 클러스터 관 2에 저장할 수 있습니다. 이차 농축 샘플 20 μL가 긴 피펫 팁을 전송하여 용균 시약 200 μl를 함유 클러스터 튜브 대응하는 (단계 3.2.1 및 3.2.2 참조). 각 샘플에 대한 새로운 피펫 팁을 사용합니다. 참고 : PCR-양 / 음 샘플의 추가 확인 분석을 위해 RT (Cronobacter) 냉장고 (살모넬라) 또는에서 기본 및 보조 농축에서 튜브를 유지합니다. </리> 용균 시약 200 μl를 함유 클러스터로 멸균 튜브 BHI 매체의 20 μl를 첨가하여 음성 대조군을 준비한다. 용해 시약 200 μl를 포함하는 클러스터 튜브에 알려진 살모넬라 또는 Cronobacter 균주 (BHI에서 재배) O / N 세균 배양의 20 μl를 추가하여 양성 대조군을 준비합니다. 캡 클러스터 튜브 단단히 상한 도구를 사용하여 고정합니다. 대상 병원체의 특정 프로그램을 선택 후 자동화 가열 블록의 클러스터 튜브 랙을 배치합니다. 또한, 10 분 동안 95 ± 3 ° C에서 배양 한 다음 20 분 동안 37 ± 2 ° C의에서 클러스터 튜브를 품어. 5 분 – (8 ° C의 2) 마지막으로, 블록을 냉각 클러스터 튜브를 전송합니다. 주 : 클러스터 분해물을 함유하는 관은 최대 2 주 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다. 6. L.의 탐지를 위해 용해를 수행 모노 사이토 의 일부를 수행다음과 같이 용해 : 완전히 해동 용해하는 제 1의 병에 무균 탈 이온수의 1.8 ML을 추가합니다. 참고 : 스토어 2에서 제 1 용균 – 사용할 준비가 될 때까지 8 ° C에서. 최대 6 개월 – (30 ° C 20) 실온에서 개방 및 희석, 저장 후. 1 비율 (희석 용해하는 제 1의 40 μL 각 샘플 당 제 2 용균의 10 μl를) : 4 제 1과 2를 용해하는 결합합니다. 결합 용해제의 양도 50 μl의 튜브를 클러스터에. 4 시간 이내에 혼합물을 사용합니다. 농축 된 시료의 일차 500 μl를 추가 결합 용해제의 50 μl를 포함하는 클러스터 튜브 (단계 3.2.3 참조). 결합 용해제 50㎕의 멸균 LEB (24) 500 μL를 첨가하여 음성 대조군을 준비한다. / N L. O의 500 μl를 첨가하여 양성 대조군을 준비 모노 사이토 문화가 결합 된 용해제의 50 μL 24 LEB 성장. 클러스터 관을 씌우고 부드럽게 장소 혼합30 분 동안 37 ± 1 ℃에서 가열 블록. 참고 : PCR-양 / 음 샘플의 추가 확인 분석을위한 냉장고에 차 농축에서 튜브를 유지합니다. 다음과 같이 용해의 파트 2를 수행합니다 : 단계 5.1 및 5.2의 지침에 따라 용해 시약을 준비합니다. 사용하여 긴 피펫 팁 용해 시약 200 μl를 포함하는 클러스터 튜브 부분 하나 해물 20 μl를 전송합니다. 각 샘플에 대한 새로운 피펫 팁을 사용합니다. 캡 클러스터 튜브 단단히 상한 도구를 사용하여 고정합니다. L.에 대한 특정 프로그램을 선택 자동화 가열 블록에있는 장소 클러스터 관 모노 사이토. 또한, 10 분 동안 95 ± 3 ° C에서 배양 한 다음 30 분 동안 55 ± 2 ° C의에서 클러스터 튜브를 품어. 5 분 – (8 ° C의 2) 마지막으로, 블록을 냉각 클러스터 튜브를 전송합니다. 주 : 클러스터 분해물을 함유하는 관은 최대 2 주 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다. 7. 수화물 PCR-준비 정제 냉장 (4 ℃로) PCR 냉각 블록을 선택하고 삽입을 통해 PCR 튜브 랙을 배치합니다. 랙 파일에 따라, 홀더의 대상 인성 병원균에 대한 (각 키트에 포함 된) PCR-준비 정제를 포함하는 PCR 튜브를 해당 놓습니다. decapping 도구를 사용하여 조심스럽게 PCR 튜브의 캡을 제거합니다. 캡을 버리고 각각의 튜브는 정제가 포함되어 있는지 확인합니다. 전송 (살모넬라 및 Cronobacter)에 50 μL 또는 특정 PCR 튜브에 해물 (L. monocytogenes에 대한) 30 μL. 새로운 광학 캡을 사용하고 상한 도구를 사용하여 PCR 튜브에 단단히 고정합니다. 참고 : – PCR 기반 탐지 시스템에로드 할 때까지 8 ° C의 PCR-준비 정제에 해물을 추가 한 후, 샘플 2의 냉각 상태를 유지해야합니다. PCR 튜브는 전체 볼륨이 바닥​​ t 있는지를 확인하기 위해 몇 초 동안 2,500 XG에서 원심 분리 될 수있다그는 튜브. 악기 서랍을 열어 PCR 자전거 타는 사람 / 탐지 시스템 악기에 PCR 튜브를 넣습니다. 서랍에있는 우물에 PCR 튜브 랙을 배치하고 튜브가 올바르게 장착되었는지 확인합니다. 서랍을 닫고 제조업체의 프로토콜에 의해 설명 된대로 프로그램을 시작합니다. 참고 : PCR 기반 장비가 각 식품 매개 병원체에 대한 순환 매개 변수를 설정되어 있습니다. PCR 순환 상태 표시 줄은 프로그램의 증폭 부분이 실행되고 있는지를 나타내는 파란색 막대가 표시되는지 확인합니다. 참고 : – 전체 3.5 시간 표준 PCR 분석법, 전체 프로그램 (증폭 및 검출)의 처리 시간이 약 3 걸린다. 8. 검토 결과 처리가 완료된 후, 화면이 샘플 및 평가 결과를 제거 PCR 기반 시스템 기기로부터의 지시에 따라 약. 표적 병원체는 인성 (하나의 샘플에 존재한다면표면 또는 비행의 소화관은) 잘가 '플러스'기호 (긍정적)으로 빨간색입니다. 병원체가 없으면, 잘은 마이너스 기호 (음수)과 녹색입니다. 웰이 중심 걸쳐 빨간색 막대 노란색 인 경우, 오류 신호를 나타낸다. PCR 양성 결과에서 세균 병원체 9. 분리 (L. monocytogenes에 대한) 기본 또는 보조에서 PCR 양성이었다 그 샘플의 농축 (살모넬라 및 Cronobacter에 대한) 선택 튜브. 다음과 같이 PCR 음성이었다 샘플의 5 % 진행 – 또한, 무작위로 3을 선택 살모넬라의 경우 : 10 라파 포트 – Vassiliadis (RV) 매체 ㎖의 테트라 티오 네이트를 1 ㎖에 (TT) 국물에 보조 농축 매체의 100 μl를 추가합니다. 24 시간 – 22 재순환 수조에서 42.5 ° C에서 튜브를 품어. 각 RV의 배양, 연속 3mm의 백금이 (10 μL) 후비스무트 파이트 (BS) 한천, 자일 로스 (xylose)의 라이신 데스 옥시 콜레이트 (XLD) 한천에 개발 TT 미디어 및 Hektoen의 장 (HE) 한천. 24 시간 – 22 35 ± 1 ° C에서 접시를 품어. 배양 후, 각 미디어에 전형적인 살모넬라 식민지의 존재에 대 한 번호판을 확인합니다. 고립 한 콜로니 여러 계대 단계 후에 수득 할 수없는 경우, 네거티브로서 샘플을 고려 PCR 기반 시스템 위양성으로보고한다. 참고 : 일반적인 살모넬라 식민지를 들어 특정 미디어 (22)를 참조하십시오. 다섯 추정 전형적인 살모넬라 식민지를 선택하고 BS, XLD에 그들을 배양, 또는 HE 격리 / 단일 콜로니의 순수한 문화를 얻을 때까지. 하나의 순수한 식민지를 선택하고, 같은 VITEK 2 식별 카드 또는 API 생화학 식별 시스템 등의 생화학 상용 테스트를 사용하여 제조사의 지침에 따라 추정 살모넬라를 식별합니다. Cronobacter의 경우 : <OL> 행진 등 R & F 엔테로 박터 sakazakii에 (Cronobacter) 발색 도금 매체 및 / 또는 ChromID sakazakii의 한천로 발색 문화 미디어의 두 접시에 보조 농축 미디어의 3mm의 백금이 (10 μL). 24 시간 – 22 ~ 35 ° C에서 접시를 품어. 배양 후, (파란색 회색에 블루 블랙) 전형적인 Cronobacter 식민지의 존재에 대 한 번호판을 확인합니다. 5 추정 Cronobacter 식민지를 선택하고 절연 / 단일 콜로니의 순수한 문화를 얻을 때까지 R & F 엔테로 박터 sakazakii에 (Cronobacter) 발색 도금 매체, ChromID sakazakii의 한천, 또는 TSA에 그들을 배양. 주 : 고립 한 콜로니 여러 계대 단계 후에 수득 할 수없는 경우, 네거티브로서 샘플을 고려-PCR 기초 검출 시스템 위양성으로보고한다. 하나의 순수한 식민지를 선택하고 생화학 commer를 사용하여 추정 Cronobacter를 식별제조업체의 지침에 따라 같은 VITEK 2 식별 카드 또는 API의 20E 생화학 식별 시스템 등 인공 테스트. L. 들어 모노 사이토 : 킬 광택 리스테리아 한천의 두 접시 (BLA)의 기본 농축 미디어의 3mm의 백금이 (10 μL). 26 시간 – 22 36 ± 1 ° C에서 접시를 품어. 배양 후, 추정 L.의 존재에 대 한 번호판을 검사 모노 사이토 (파란색 녹색) 식민지. 선택 5 추정 L. 모노 사이토 식민지와 격리 / 단일 콜로니의 순수한 문화를 얻기까지 BLA에 그들을 배양. 26 시간 – 추가 (22) 36 ± 1 ° C에서 음극판을-품어 다시. 하나의 순수한 식민지를 선택하고 추정 L.를 식별 제조업체의 난 다음, 이러한 VITEK 2 식별 카드 또는 API 리스테리아 생화학 식별 시스템 같은 상용 생화학 검사를 이용하여 모노 사이토 겐nstructions. 곤충에서 분리 추정 식 인성 병원균 더 확인과 기준 실험실에서 혈청 중화되어야한다.