Una Perspectiva Técnica en Modern Árbol-anillo de Investigación - Cómo superar dendroecológica y madera anatómicas Desafíos
Summary
Here we present a protocol outlining how to sample wooden specimens for the overall assessment of their growth structures. Macro- and microscopic preparation and visualization techniques necessary to generate well-replicated and highly resolved wood anatomical and dendroecological dataset, are described are described.
Abstract
Investigación dendroecológica utiliza la información almacenada en los anillos de árboles para entender cómo los árboles individuales e incluso los ecosistemas forestales enteras respondieron a los cambios ambientales y para finalmente reconstruir dichos cambios. Esto se hace mediante el análisis de las variaciones de crecimiento atrás en el tiempo y correlacionar diversos parámetros específicos de la instalación a (por ejemplo) los registros de temperatura. La integración de la madera parámetros anatómicos en estos análisis reforzaría reconstrucciones, incluso hasta resolución intra-anual. Por lo tanto, presentamos un protocolo sobre cómo muestrear, preparar y analizar muestras de madera para el análisis macroscópico comunes, sino también para los análisis microscópicos posteriores. Además se introduce una solución potencial para el análisis de imágenes digitales generadas a partir de muestras pequeñas y grandes comunes para apoyar el análisis de series de tiempo. El protocolo presenta los pasos básicos, ya que en la actualidad se pueden utilizar. Más allá de esto, hay una necesidad continua para la mejora de las técnicas existentes, y el desarrollo de la nueva techniques, para registrar y cuantificar los procesos ambientales pasados y presentes. Investigación anatómica de madera tradicional necesita ser ampliado para incluir información ecológica para este campo de investigación. Esto apoyaría dendro-científicos que tengan la intención de analizar nuevos parámetros y desarrollar nuevas metodologías para comprender los efectos a corto y largo plazo de los factores ambientales específicos sobre la anatomía de las plantas leñosas.
Introduction
Los árboles, así como arbustos, arbustos enanos, e incluso hierbas, muestran patrones de respuesta múltiple relacionados con los cambios en su entorno. Estos patrones han sido objeto de la botánica y fisiología vegetal desde mediados del siglo 19. En aquel entonces, la investigación de plantas leñosas se centró principalmente en los árboles y un análisis descriptivo de la estructura y la variabilidad de los anillos anuales en un contexto ecológico 1. Cuando Andrew Ellicott Douglass inventó la técnica cruzada de citas para la investigación de los anillos 2, este contexto ecológico fue más o menos reprimida por la nueva capacidad de la fecha con precisión los resultados de madera en la arqueología. Cruz-citas por primera vez permitió a la datación exacta de los anillos de árboles al año natural y se hasta ahora considerado como la columna vertebral de la investigación de anillos de árboles en todos los campos de su aplicación 1.
Paralelamente, desde finales del siglo 19, anatomía de la madera se convirtió en una disciplina de investigación importante se relacionad para muchos otros campos de las ciencias naturales y aplicadas 3. Dos dominios principales se establecen: la anatomía sistemática madera, que es la base para la identificación de la madera en arqueología 4, y la anatomía de la madera aplicada, relacionados con tecnología de la madera, la fisiología, la patología y la ecología 3,5.
En la investigación de anillos de árboles, Dendroecología hoy en día se define como un tema que abarca estudios de anillos de árboles relacionados centrados en estudios ambientales, como los procesos geomorfológicos (Dendrogeomorfología), temperatura y reconstrucciones de precipitación (dendroclimatología), cambios de nivel de agua (dendrohydrology) o incluso fluctuaciones de los glaciares ( dendroglaciology) 6. Como esta definición indica, los análisis de anillos de árboles se han vuelto cada vez más importante en el campo de las citas y la reconstrucción de los procesos ambientales, tales como (i) pasadas condiciones climáticas mediante el análisis de las variaciones anuales en el ring ancho 7,8, densidad de la madera 9 o isótopos 10, o (ii) tque la recurrencia intervalos de procesos geomorfológicos 11. Estos estudios muy detallados sobre las variaciones de anillos de ancho y su contenido isotópico demuestran la necesidad de analizar los anillos con más detalle, es decir, el estudio de la estructura anatómica de los anillos. Sin embargo, los estudios detallados de madera características anatómicas dentro de los anillos anuales relacionados con los cambios ambientales son raros 12,13. Aunque estas características microscópicas se conocen 14, rara vez se han aplicado a nivel microscópico para la investigación dendroecológica. Además, el momento exacto de estas reacciones de crecimiento en árboles cultivados de forma natural, esenciales para los propósitos exactos de citas, rara vez se ha documentado recientemente 15.
En cuanto a los efectos del calentamiento global 16, la mejora de los ya existentes y el desarrollo de nuevas técnicas para registrar y cuantificar pasadas y actuales procesos ambientales se requiere, sobre todo en términos de Investigación del Impacto Climático 11.Con la ampliación de la investigación anatómica madera tradicional a una anatomía de la madera con base ecológica 17, dendro-científicos pueden analizar nuevos parámetros y desarrollar nuevas metodologías para entender los efectos a corto y largo plazo los efectos de los factores ambientales específicos sobre la anatomía de las plantas leñosas 18. El conocimiento detallado acerca de las variaciones en los diferentes parámetros de las células dentro de los anillos individuales relacionados con controladores específicos (por ejemplo, fuerzas mecánicas, las variaciones climáticas) es el requisito básico para la comprensión de la variabilidad en la formación de anillos de árboles. En comparación con las mediciones de anillo ancho comunes, la identificación de las variaciones anatómicas de madera requiere técnicas de preparación más complejas y extensas que requieren mucha mano de obra y tiempo. Los procedimientos detallados de corte de la muestra, las manchas, y la inclusión son múltiples y dependen siempre de que el objetivo del estudio 19.
Para el análisis macroscópico de ancho de anillos de coníferas o estructuras incluso para el número, tamaño o distribution de naves en maderas duras, la superficie de una muestra se pule comúnmente usando papel de lija fino o rectificadoras especiales 20. Una desventaja de este procedimiento es el llenado de las celdas individuales con el polvo que impide su posterior análisis microscópico semiautomática 21. Los mejores resultados para la preparación de muestras macroscópicas se consiguen cuando la superficie de la muestra se cortan con una cuchilla de afeitar u otro cuchillo afilado.
Mientras que para las muestras pequeñas, hojas de afeitar son una herramienta perfecta; muestras más grandes como núcleos requieren el corte de superficies planas en toda la extensión de los núcleos. En contraste con el lijado, las células no se llenan de polvo, que permite además la preparación para el análisis de imágenes sucesivas. Además, el lumen de célula abierta, las paredes celulares adecuadamente cortados, y la superficie plana de la muestra entera permiten la aplicación de la densitometría de alta frecuencia 22 a toda la extensión del núcleo. Para análisis de imágenes, la superficie de las muestras (célulaparedes) se pueden teñir con tinta oscura y el lumen de células abiertas posteriormente se pueden llenar con tiza blanca para mejorar el contraste entre la pared celular y el área del lumen 19,23. Esta bastante simple técnica permite una evaluación macroscópica básica de las estructuras celulares más grandes para las mediciones de tamaño de los buques.
Estas técnicas para el corte de superficies planas son suficientes para los análisis macroscópicos. Para una detallada anatómica madera (es decir, microscópica) análisis, microscopía de luz transmitida es el método más común aplicada en ciencias dendro. Células del xilema se diferencian a través de procesos complejos que abarcan la determinación del tipo de célula, la división celular, la diferenciación celular, y muerte celular programada 24. Desde el momento y la velocidad a la que estos procesos ocurren determinar las características anatómicas de células, las condiciones ambientales que afectan a estos procesos pueden generar desviaciones anatómicas en la estructura del anillo. Como una condición importante para ellos analizans, micro secciones tienen que estar preparados con un micrótomo 19. Cuando la preparación de muestras para seccionar, la visibilidad de la dirección de traqueidas o fibra es crucial. Se recomienda el uso de deslizamiento impulsado micrótomos mano para cortar secciones micro porque esta técnica facilita secciones de alta calidad como sea necesario para una imagen análisis 19. Dependiendo del objetivo específico de un determinado estudio, micro se cortan secciones perpendicular o paralelo a la extensión longitudinal de las células. Estas secciones se fotografiaron por debajo de un microscopio y dimensiones de la celda medidos utilizando una imagen especializada análisis de software.
Hasta hace poco, la capacidad de preparar micro secciones se restringió a los pequeños tamaños de muestra solamente (aproximadamente 1 cm x 1 cm). Esto es aceptable para analizar los eventos individuales como disturbios en años concretos, pero esta técnica no permite el análisis de series de tiempo prolongado necesario para reconstrucciones ambientales. Este esfuerzo sólo puede darse cuentaD a través del desarrollo de nuevos, eficientes y económicos los procedimientos de preparación y técnicas analíticas. En los últimos años, los miembros del laboratorio de anillos de árboles en el Swiss WSL Instituto Federal de Investigaciones en Suiza han iniciado un intenso trabajo sobre este tema. Como resultado, los nuevos dispositivos y técnicas de análisis han sido desarrollados para apoyar la idea de la integración de características anatómicas de la madera a una amplia gama de temas de investigación ambiental.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los retos de una integración exitosa y sostenible de anatomía de la madera en la investigación dendroecológica son, aparte de problemas analíticos múltiples, sobre todo debido a los aspectos técnicos. Estos desafíos van desde el muestreo principio se acerca a la creación de secciones micro de alta calidad y su posterior análisis 19.
A primera vista, la toma de muestras de núcleos o incluso discos es un procedimiento simple que se conoce desde hace muchos años. Hay muchas cosas que se pueden hacer mal y una pequeña imprecisión en el muestreo puede resultar en problemas graves durante las fases de preparación y análisis posteriores. Inexactitudes pequeños, tales como extracción de muestras que no es exactamente perpendicular al eje del vástago o el uso de un descorazonador imperfectamente afilado no son un problema si el objetivo del estudio se limita a sonar de ancho mediciones. Sin embargo, cuando el objetivo para el análisis microscópico de las muestras, una dirección de muestreo incorrecto podría resultar en distorsiones ópticas deparedes celulares, mientras que el uso de Corers romos resultados en micro grietas dentro del núcleo. Como resultado, cuando se trata de cortar micro secciones de estos núcleos, las secciones delgadas se derrumbe y una preparación eficiente ya no está garantizada. Lo mismo es cierto para el muestreo micro-núcleo. Una punta roma dará lugar a alta presión cuando la perforadora está clavado en la madera del tronco. En consecuencia, la capa de cambium será comprimido. Las células del cambium (Figura 5) se exprimido y en consecuencia no pueden ser analizados.
Muestreo del disco es sin duda la mejor estrategia en el análisis de las variaciones de crecimiento para relacionarlas con los cambios ambientales. Por desgracia, es simplemente imposible tomar los discos de todos los árboles destinados a muestrear para análisis posteriores. Sin embargo, especialmente en caso de dendrochronology tropical, se necesita una cierta cantidad de discos de tallo en combinación con núcleos de incremento. Los discos se usan como una base para definir los límites de anillo y por esta para apoyar la boundaries definidos basados en el análisis de tacos de crecimiento 12,27,28.
Los pros y los contras de lijado frente de corte se discuten con frecuencia 1,11,21. Como se ha mencionado anteriormente, el mejor procedimiento depende siempre de la pregunta de investigación y los parámetros a analizar (macroscópica o microscópica). Si los análisis isotópicos o químicos se proyectan en una etapa de trabajo adicional, es de suma importancia que el polvo abrasivo creado por el lijado que puede llenar en lúmenes de las células en toda la muestra, se retira cuidadosamente con una aspiradora o aire a presión.
Cortar micro secciones es para todos microscópica analiza la forma más adecuada de preparación de muestras para análisis adicionales. En primer lugar, la sección se corta la muestra, que luego se puede mantener sin ninguna contaminación potenciales para análisis adicionales. En segundo lugar estas secciones permiten mediciones de alta resolución de los parámetros de una sola célula. Además, evitando la incrustación tiempotécnica mediante el uso de una solución de almidón de maíz 26 para estabilizar las células es una gran ventaja en micro seccionamiento.
Una desventaja de micro seccionamiento sigue siendo el tamaño limitado de la muestra resultante en largos tiempos de preparación. Para los análisis de series de tiempo real que se remonta en el tiempo durante siglos o incluso milenios, hay una necesidad de desarrollar más los dispositivos existentes de corte 17,19, pero también de procesamiento de imágenes y análisis de 18. Un primer paso en esta dirección es el desarrollo de la microtomo núcleo 21, fabricado inicialmente para cortar superficies planas sobre núcleos (Figura 1). Pruebas recientes revelaron la capacidad de cortar micro secciones de núcleos enteras usando este dispositivo (Figura 1).
Secciones micro de alta calidad proporcionan el principio básico para un análisis de imagen eficaz. Tomando las imágenes en el microscopio es un procedimiento común 19, pero su análisis efectivo sigue siendo una tarea que necesitaun mayor desarrollo 17. Todos los sistemas de análisis de imagen existentes son semi-automática, es decir, tienen que ser más o menos intensamente controlado por el técnico. En muchos casos, las imágenes deben ser corregidos o incluso imágenes nuevas tienen que hacer para mejorar el contraste para un mejor registro de las estructuras por el software sin necesidad de cambiar el grosor de la pared celular dentro de la imagen.
Herramientas de análisis de imagen especializados, tales como ROXAS 18, WinCell o secuencias de comandos específicos para ImageJ 29 son capaces de proporcionar datos anatómicos básicos, tales como el número de células, la dimensión célula, espesor de la pared celular y la posición de la celda dentro del anillo anual. Muchos métricas anatómicas adicionales que son relevantes en un contexto dendroecológica se pueden calcular a partir de estas mediciones básicas tales como el tamaño de los conductos más grandes, la distribución del tamaño de los conductos, el tamaño de la madera temprana o de la primera fila de conductos, (óptico) densidad de la madera, intra-anual perfiles de tamaño del conducto y la pared celularde espesor, y patrones de asociación de conductos (solitaria, múltiplos, etc.).
Utilizando el software ROXAS 18, los contornos de lumina conducto (es decir, células conductor de agua) y las fronteras anuales anillo se reconocen automáticamente y representan visualmente como superposiciones más de la imagen original. Algoritmos de detección de los conductos se basan en el color, el tamaño y la información de la forma, los algoritmos de detección de fronteras de anillo en el contexto local de cada conducto. Una caja de herramientas nos permite mejorar manualmente estos resultados editando directamente las características de superposición, es decir, la supresión, adición y modificación de las fronteras del anillo y el conducto contornos. Después de la edición, la salida de datos final, incluyendo el espesor de la pared celular (coníferas), se genera y se guarda en una hoja de cálculo de forma automática. Sistemas automatizados totalmente Actualmente no disponible, ni siquiera para las coníferas que muestran una estructura relativamente simple, pero esto es un objetivo para futuros desarrollos. Esto apoyaría firmemente la fuintegración ll de parámetros anatómicos de madera en análisis de series temporales.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the effort of Sandro Lucchinetti (Schenkung Dapples, Zürich) for constructing the devices needed to guarantee progress in sample preparation.
Materials
| Increment corer | http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article &id=57&Itemid=88&lang=en |
||
| Core-Microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
| Laboratory microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
| Trephor micro corer | http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp | ||
| Nawashin solution | Ten parts 1% chromic acid, four parts 4% formaldehyde and one part acetic acid | ||
| Picric-Anilin blue | One part saturated aniline blue and four parts Trinitrophenol dissolved in 95% ethanol | ||
| Safranin | Empirical Formula (Hill Notation) C20H19ClN4 | ||
| Astra-blue | Empirical Formula (Hill Notation) C47H52CuN14O6S3 | ||
| Ethanol | Linear Formula CH3CH2OH | ||
| Xylol (Xylene) | Linear Formula C6H4(CH3)2 | ||
| Canada Balsam | Embedding solution for microscopy | ||
| Roxas Software | http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN | ||
| ImageJ Software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| WinCell | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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