Uma perspectiva técnica em Modern Tree-anel Research - Como superar dendroecologia e Madeira anatômicas Desafios
Summary
Here we present a protocol outlining how to sample wooden specimens for the overall assessment of their growth structures. Macro- and microscopic preparation and visualization techniques necessary to generate well-replicated and highly resolved wood anatomical and dendroecological dataset, are described are described.
Abstract
Pesquisa dendroecologia usa informações armazenadas em anéis de árvores para entender como árvores isoladas e até ecossistemas florestais inteiras respondeu às mudanças ambientais e finalmente reconstruir tais mudanças. Isto é feito através da análise de variações de crescimento de volta no tempo e correlacionando vários parâmetros específicos para cada planta para (por exemplo) os registros de temperatura. Integrando parâmetros anatômicos da madeira nessas análises reforçaria reconstruções, mesmo de resolução intra-anual. Por isso, apresentamos um protocolo sobre a forma de amostra, preparar e analisar amostras de madeira para análises macroscópicas comuns, mas também para análises microscópicas subseqüentes. Além disso, apresentamos uma solução potencial para a análise de imagens digitais geradas a partir de pequenas e grandes espécimes comuns de apoio de séries temporais analisa. O protocolo apresenta os passos básicos, dado que actualmente podem ser usadas. Além disso, há uma necessidade constante para o aprimoramento das técnicas existentes e desenvolvimento de novos techniques, para registrar e quantificar os processos ambientais passados e em curso. Pesquisa de madeira tradicional anatômica precisa ser ampliado para incluir informações ecológica para esse campo de pesquisa. Este apoiaria dendrologicos cientistas que pretendem analisar novos parâmetros e desenvolver novas metodologias para compreender os efeitos de curto e longo prazo dos fatores ambientais específicos sobre a anatomia de plantas lenhosas.
Introduction
Árvores, bem como arbustos, arbustos anões, e até mesmo ervas, mostram padrões de respostas múltiplas relacionadas a mudanças em seu ambiente. Esses padrões têm sido objecto de botânica e fisiologia das plantas desde meados do século 19. Naquela época, a pesquisa sobre plantas lenhosas focada principalmente em árvores e em uma análise descritiva da estrutura e variabilidade dos anéis anuais em um contexto ecológico 1. Quando Andrew Ellicott Douglass inventou a técnica de cruzamento de namoro para a pesquisa de anéis de árvores 2, neste contexto ecológico foi mais ou menos suprimida pela nova capacidade de datar com precisão achados de madeira em arqueologia. -Dating Cruz pela primeira vez permitiu a datação precisa de anéis de árvores para o ano civil e é até hoje considerada a espinha dorsal da pesquisa de anéis de árvores em todos os campos da sua aplicação 1.
Em paralelo, desde o final do século 19, anatomia da madeira evoluiu para uma disciplina de pesquisa importante relacionard a muitos outros campos das ciências naturais e aplicadas 3. Dois domínios principais são estabelecidos: a anatomia sistemática de madeira, que é a base para a identificação de madeira em arqueologia 4, ea anatomia da madeira aplicada, relacionada à tecnologia da madeira, fisiologia, patologia e ecologia 3,5.
Na pesquisa de anéis de árvores, dendroecologia hoje em dia é definido como um tema que abrange estudos de anéis de árvores relacionadas com foco em estudos ambientais, tais como processos geomorfológicos (dendrogeomorphology), temperatura e precipitação reconstruções (dendroclimatologia), alterações do nível da água (dendrohydrology) ou mesmo flutuações Glacier ( dendroglaciology) 6. Como esta definição indica, análises de anéis de árvores tornaram-se cada vez mais importante no campo do namoro e reconstruir processos ambientais, tais como (i) condições climáticas do passado, analisando as variações anuais no anel de largura 7,8, densidade da madeira 9 ou isótopos 10, ou (ii) tele recorrência intervalos de processos geomorfológicos 11. Estes estudos muito detalhados sobre variações anel de largura e seu conteúdo isotópico demonstrar a necessidade de analisar os anéis com mais detalhes, ou seja, para estudar a estrutura anatômica dos anéis. No entanto, estudos detalhados de características anatômicas da madeira dentro dos anéis anuais relacionadas às mudanças ambientais são raros 12,13. Embora essas características microscópicas são conhecidas 14, eles raramente têm sido aplicadas em um nível microscópico para pesquisa dendroecologia. Além disso, o momento exato dessas reações de crescimento em árvores cultivados naturalmente, essenciais para fins de datação exata, tem sido raramente documentado recentemente 15.
Com relação aos efeitos do aquecimento global 16, a melhoria das existentes e desenvolvimento de novas técnicas para registrar e quantificar os processos ambientais passados e em curso é necessária, especialmente em termos de clima de investigação impacto 11.Ao expandir a investigação anatômica de madeira tradicional para uma anatomia da madeira ecologicamente baseado 17, dendrologicos cientistas podem analisar novos parâmetros e desenvolver novas metodologias para compreender a curto e longo prazo efeitos de fatores ambientais específicos sobre a anatomia de plantas lenhosas 18. O conhecimento detalhado sobre as variações nos parâmetros de células diferentes dentro de anéis individuais relacionados com drivers específicos (por exemplo, forças mecânicas, variações climáticas) é o requisito básico para a compreensão da variabilidade na formação dos anéis de árvore. Em comparação com as medições do anel de largura comuns, identificando variações anatômicas da madeira requer técnicas de preparação mais complexas e amplas que requerem uma grande quantidade de mão de obra e tempo. Os procedimentos detalhados de corte da amostra, a coloração, e incorporação são múltiplas e estão sempre dependentes do objetivo do estudo 19.
Para a análise macroscópica da largura do anel de coníferas ou mesmo estruturas para o número, tamanho ou distribution de navios em madeiras de lei, a superfície de uma amostra é comumente polidas com lixa fina ou máquinas especiais de moagem de 20. Uma desvantagem deste procedimento é o enchimento das células individuais com a poeira que impede ainda mais a análise microscópica semi-automática 21. Os melhores resultados para a preparação da amostra macroscópica são alcançados quando a superfície da amostra são cortados com uma lâmina de barbear ou de outra faca afiada.
Enquanto para pequenas amostras, lâminas de barbear são uma ferramenta perfeita; amostras maiores como núcleos requerem o corte de superfícies planas ao longo de toda a extensão de núcleos. Em contraste com o lixar, as células não são preenchidos com pó, o qual permite que as operações de preparação para a análise de imagens sucessivas. Além disso, o lúmen de células abertas, as paredes celulares adequadamente cortados, e a superfície do plano da amostra inteira permitir a aplicação de alta frequência densitometria 22 a toda a extensão do núcleo. Para análise de imagem, a superfície das amostras (célulaparedes) pode ser corada com tinta escura e o lúmen de células abertas podem ser utilizados posteriormente com giz branco para melhorar o contraste entre a parede da célula e a área do lúmen 19,23. Esta técnica bastante simples permite uma avaliação macroscópica de base das estruturas celulares maiores, para medições do tamanho do vaso.
Estas técnicas para cortar superfícies planas são suficientes para a análise macroscópica. Para uma detalhada análise anatômica de madeira (ou seja, microscópica), microscopia de luz transmitida é o método mais comum aplicado nas ciências dendrologicos. Diferenciar células do xilema por meio de processos complexos que abrangem tipo celular determinação, divisão celular, diferenciação celular, a morte celular programada e 24. Desde o momento eo ritmo a que esses processos ocorrem determinar as características anatômicas de células, as condições ambientais que afetam esses processos podem gerar desvios anatômicos na estrutura do anel. Como uma condição importante para estes analisars, seções micro precisa estar preparado com um micrótomo 19. Quando a preparação de amostras para uma secção transversal, a visibilidade da direcção traqueídeos ou fibra é crucial. É recomendado o uso de normas ditadas micrótomos deslizamento mão para cortar seções micro porque esta técnica facilita seções de alta qualidade, conforme necessário para análise de imagem 19. Dependendo do objectivo específico de um determinado estudo, as lâminas microscópicas são cortadas perpendicularmente ou paralelamente à extensão longitudinal das células. Essas seções são então fotografadas abaixo de um microscópio e dimensões celulares medidos usando imagem especializado analisa software.
Até recentemente, a capacidade de preparar as lâminas microscópicas foi restringido para amostras de pequenas dimensões apenas (aproximado 1 cm x 1 cm). Isto é aceitável para analisar eventos únicos como distúrbios em anos específicos, mas esta técnica não permite a análise de séries temporais necessário alargado para reconstruções ambientais. Este esforço só pode ser perceberd através do desenvolvimento de novos, eficientes e econômicas procedimentos de preparação e técnicas de análise. Nos últimos anos, os membros do laboratório de anéis de árvores no Swiss WSL Instituto Federal de Investigação, na Suíça começaram um trabalho intenso sobre este tema. Como resultado, os novos dispositivos e técnicas de análise foram desenvolvidos para suportar a ideia de integrar características anatômicas da madeira para uma ampla gama de temas de investigação ambiental.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os desafios de uma integração bem sucedida e sustentável da anatomia da madeira em pesquisa dendroecologia são, além de problemas analíticos múltiplas, principalmente devido a aspectos técnicos. Estes desafios vão desde princípio de amostragem abordagens para a criação de micro seções de alta qualidade e sua posterior análise 19.
À primeira vista, a amostragem de núcleos ou até mesmo discos é um procedimento simples que tem sido conhecido por muitos anos agora. Há muitas coisas que podem ser feitas errado e uma pequena imprecisão na amostragem pode resultar em problemas graves durante as fases de preparação e posterior análise. As pequenas imprecisões como descaroçamento que não é exactamente perpendicular ao eixo da haste, ou usando uma sonda imperfeitamente aguçada não são um problema se o objectivo do estudo é restrito ao anel de largura de medições. No entanto, quando se aponta para a análise microscópica das amostras, uma direco de amostragem incorrecta pode resultar em distorções ópticas deparedes das células, enquanto que o uso de rombos corers resultados em micro fissuras dentro do núcleo. Como resultado, ao tentar cortar micro seções destes núcleos, as seções finas apenas desmoronar e uma preparação eficiente não é mais garantida. O mesmo é verdade para a amostragem de micro-núcleo. A ponta romba irá resultar em pressão alta quando o perfurador é martelado em madeira do tronco. Por conseguinte, a camada cambial será comprimido. As células do câmbio (Figura 5) são, consequentemente, espremida e não pode ser analisado.
Disco de amostragem é de fato a melhor estratégia quando se analisa as variações de crescimento para relacioná-los às mudanças ambientais. Infelizmente, é simplesmente impossível tomar discos de todas as árvores destinadas a serem amostrados para análises posteriores. No entanto, especialmente no caso de dendrochronology tropical, uma certa quantidade de discos tronco é necessário em combinação com núcleos de incremento. Os discos são usados como base para definir os limites de anel e, por esta para apoiar o boundaries definido com base na análise de núcleos de incremento 12,27,28.
Os prós e contras de lixar contra corte são frequentemente discutidos 1,11,21. Como mencionado acima, o melhor procedimento depende sempre da questão de pesquisa e os parâmetros a serem analisados (macroscópica ou microscópica). Se as análises isotópicas ou químicos são projetadas em um passo de trabalho adicional, é de extrema importância que o pó abrasivo criado por lixar que podem preencher em Lumina celular ao longo de toda a amostra, é cuidadosamente removido por aspiração ou ar pressão.
Cortar seções micro é para todos microscópica analisa a forma mais adequada de preparação de amostras para análises posteriores. Em primeiro lugar, a secção é cortada da amostra, que então pode ser mantido sem qualquer contaminação potencial para análises posteriores. Segundo essas seções permitem medições de alta resolução de parâmetros de célula única. Além disso, evitar a incorporação demoradotécnica, utilizando uma solução de amido de milho 26 para estabilizar as células é uma grande vantagem em micro corte.
A desvantagem de micro corte ainda é o tamanho da amostra limitada, resultando em longos tempos de preparação. Para as análises de séries temporais reais voltar no tempo ao longo de séculos ou mesmo milênios, há uma necessidade de desenvolver dispositivos existentes corte 17,19, mas também análise e processamento de imagem 18. Um primeiro passo neste sentido é o desenvolvimento de micrótomo do núcleo 21, inicialmente fabricado para cortar superfícies planas sobre os núcleos (Figura 1). Testes recentes revelaram a capacidade de corte de micro-secções de núcleos inteiros com este dispositivo (Figura 1).
Seções micro alta qualidade fornecem o princípio básico para uma análise de imagem eficaz. Tomando as imagens sob um microscópio é um procedimento comum de 19, mas a sua análise eficaz ainda é uma tarefa que precisacontinuar a ser desenvolvidos 17. Todos os sistemas de análise de imagem existentes são semi-automática, ou seja, eles precisam ser mais ou menos intensamente controlado pelo técnico. Em muitos casos, as imagens precisam ser corrigidos ou mesmo novas imagens têm de ser feitas para melhorar o contraste para um melhor registro das estruturas por parte do software sem alterar espessura da parede celular dentro da imagem.
Ferramentas de análise de imagem especializadas, como Roxas 18, WinCell ou os scripts específicos para ImageJ 29 são capazes de fornecer dados anatômicos básicos, tais como o número de células, a dimensão da célula, espessura da parede celular e posição da célula dentro do anel anual. Muitas métricas adicionais anatómicas que são relevantes em um contexto dendroecologia pode ser calculada a partir destas medições básicas, tais como o tamanho das maiores condutas, condutas de distribuição de tamanho, o tamanho de lenho inicial ou a primeira fila de condutas, (óptico) a densidade da madeira, intra-anual perfis de tamanho conduta e da parede celularespessura, e os padrões de agrupamento de condutas (solitária, múltiplos, etc.).
Usando o software Roxas 18, os contornos de Lumina conduta (ou seja, a água celular condução) e fronteiras anuais anel são automaticamente reconhecidos e visualmente representadas como sobreposições sobre a imagem original. Algoritmos de detecção de condutas são baseadas em cor, tamanho e informação da forma, os algoritmos de detecção de borda do anel sobre o contexto local de cada conduta. Uma caixa de ferramentas permite-nos melhorar manualmente estes resultados editando diretamente os recursos de sobreposição, ou seja, suprimir, acrescentar e modificar as fronteiras anel e conduta descreve. Após a edição, a saída de dados final, incluindo a espessura da parede celular (coníferas), é gerado e salvo em uma planilha automaticamente. Totalmente sistemas automatizados não estão disponíveis, nem mesmo para as coníferas que mostram uma estrutura relativamente simples, mas este é um objetivo para futuros desenvolvimentos. Isso iria apoiar fortemente o fuintegração ll de parâmetros anatômicos da madeira em análises de séries temporais.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the effort of Sandro Lucchinetti (Schenkung Dapples, Zürich) for constructing the devices needed to guarantee progress in sample preparation.
Materials
| Increment corer | http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article &id=57&Itemid=88&lang=en |
||
| Core-Microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
| Laboratory microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
| Trephor micro corer | http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp | ||
| Nawashin solution | Ten parts 1% chromic acid, four parts 4% formaldehyde and one part acetic acid | ||
| Picric-Anilin blue | One part saturated aniline blue and four parts Trinitrophenol dissolved in 95% ethanol | ||
| Safranin | Empirical Formula (Hill Notation) C20H19ClN4 | ||
| Astra-blue | Empirical Formula (Hill Notation) C47H52CuN14O6S3 | ||
| Ethanol | Linear Formula CH3CH2OH | ||
| Xylol (Xylene) | Linear Formula C6H4(CH3)2 | ||
| Canada Balsam | Embedding solution for microscopy | ||
| Roxas Software | http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN | ||
| ImageJ Software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| WinCell | http://imagej.nih.gov/ij/ |
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