現代の木リング研究の技術的な観点 - Dendroecologicalと木材解剖課題を克服する方法

1.サンプリング技術コアサンプリングサンプリングの木の茎のために、それぞれがその成長発達を分析するために、幹から増分コアラーを使用して、少なくとも2つのコアを抽出する。一般的な気候再構成はコアが斜面に平行に取るために、 例えば 、研究課題上のサンプリングの位置を変更します。熱帯種で作業する場合、少なくとも3つ以上のコアを取る。 先鋭化増分コアラ（直径5、10または12ミリメートル）を使用し、ステムの成長軸に垂直なコアラを置く。 注：ツリーにそれを掘削する際、その回転以外のコアラの動きを避けるために、プッシャーを使用して、コアラの制御され、安定した位置を持っている。幹に穴髄へとを介してすべての方法。コア非常に密度の高い木（ すなわち 、熱帯種）に、Diospyrusのebenumなどのコアにも密な森の中に許可する増分コアのアダプター（黒檀）で特別な再構成チェーンソー体を使用しています。</ LI> 抽出器を使用し、木から生じるコアを取り除く。コアラを切り、茎から取り外します。 その後コア上に直接配置されているテープ、上の書き込みによってソフト鉛筆を使用して抽出コアに特定のIDを追加します。ステムの反​​対側に手順を繰り返します。 ツリーの2つのサンプルは、任意の損傷を防ぐためにプラスチックや紙管または特殊な箱に保管してください。 注：これらは、成形からコアを防ぐため、紙のストローは、熱帯の環境では特に有益である。 最後に、木製の支持梁上のコア（繊維方向直立）をマウント。冷たい水に強い木材接着剤を使用し、それらを乾燥させます。 注：研究の目的は、さらなる化学、同位体または密度分析が含まれている場合は、木製の支持体上のコアを取付けないでください。これらの目的のために、オープンケーブル導管または片面段ボードでコアを固定します。 マイクロコアサンプリング特殊なパンチングデバイスを使用して、または2ミリメートルの開口部と針。樹皮の厚さに応じて、樹皮の必要な部分を除去するためにノミを使用しています。 上記のように茎の成長軸に垂直なデバイスを配置し、深さ約2​​cmまで茎の木部に浸透するハンマーを使用しています。 ツール内部の結​​果のマイクロコアを破壊し、ステムから削除するには、針を回します。マイクロ遠心バイアルにマイクロコアを保存し、それらにラベルを付ける。 ディスクのサンプリング特殊なケースでは（特に熱帯で）、 例えば切り株や倒木や、可能な限りのサンプリング時に、チェーンソーでディスク（成長軸に垂直な断面）を取る。単純にディスクにラベルを付け、さらなる分析まで保管してください。 注：このサンプリング手順は、最も一般的に増分corersの使用を許可していないすべてのドライ死んで、歴史的、考古学的およびサブ化石材料としてだけでなく、非常に密度の高い広葉樹のために適用されます。 </ol> 2.試料の調製サンディングディスクサンディングマシンにディスクを置き、120、220、300グリット続いて、80グリットのサンドペーパーから開始し、次第に細かい砥粒の配列を用いて表面を研削する。 400グリットを有する最終研磨は、ほとんどの針葉樹のために十分である。広葉樹、特に熱帯種のために、成長リングの境界を区別するために1200にサンディンググリッツを使い切る。 コア上平面切断面彼らの全体の範囲にわたってコア上の平面の表面をカットする可能新たに開発したコアミクロトームのコアホルダーの増加コアを固定してください。 注：ミクロトームのナイフに直角である直立試料の繊維方向を持つようにホルダー内のコアの向きを修正してください。 それは少しブレードに接触するまでコアを持ち上げます。 CUにコアの範囲を越えたボールベアリングのガイダンスに固定されているブレードを、プル上部の最初の部分をオフトン。 、コアの後ろにナイフを押し戻すコア約10μmで試料ホルダーを持ち上げ、切断手順を繰り返します。コアの直径の約3分の1は、連続平面になり伐採されるまで、これを行います。 トウモロコシデンプ​​ン溶液を添加することによって、マイクロ切片を調製した。 解剖学的構造の詳細な画像解析のために、固定コアまたは他のサンプルは、ミクロトームのホルダーでディスクから分離する。サンプルの上部の縁に新たに開発されたスレッジミクロトームのボールベアリング指導によって導かミクロトーム刃を、置き、その上に引き出します。 約20から30μmでサンプルを持ち上げて、もう一度サンプル上のブレードを引っ張ってブレードを押し戻す。サンプルの上に連続面が作成されるまで、この手順を繰り返します。 コー​​ンスターチ溶液（コーンスターチ10gを、8mlの水、および100％のグリセロ7gので得られた表面を覆う一般的なブラシ付きL）。 NOTE：デンプン粒は、薄切片のその後の切断のための構造を安定化するために、サンプルの気泡を埋める。 、15μmでサンプルを持ち上げ、試料の表面にブラシを配置し、（ブラシ下）薄い部分を切断し始めてサンプルに向かってゆっくりと刃を引っ張る。カットしながら、結果のセクションでは、ブラシによって導かブレード上を摺動する。 セクション全体が切断されると、ブラシと水とブレードからマイクロセクションを削除（摩擦を低減するために）、さ​​らなる製造のためのガラススライド上のセクションを配置。乾燥するのを防ぐために、グリセロールの少量（33％= 100％グリセロールの一部と水の2つの部分）を使用して、それらをカバー。 3.マイクロスライドの準備恒久的なスライドの以下の調製のために、第1ピペットと水でマイクロセクションから離れてグリセロールを洗う。 ぬれたSEをカバーリグニンと非木質化を区別するサフラニン（サフラニン粉末+ 100mlの水を1g）とAstrablue（100％酢酸+水100mlのアストラ青色粉末+ 2mlを0.5g）を数滴とction構造だけでなく、後続の画像解析のためのコントラストを向上させる。 色素によってカバーされ、5分間のセクション残りをしましょう​​と、再びピペットと水で洗い流す。 できるだけ早く過度色素が除去されるように、希釈し、75％、96％の配列、最後に100％エタノールでそれらを洗浄することにより、ピペットのセクションを脱水する。 使用ピペット全体ではなく、脱水処理には約2〜3分の処理時間を短縮する浴中に試料を配置するスライドガラスでサンプルをリンスする。 注：エタノールで脱水が破損脆弱なサンプルを防ぎます。 その後、100％のキシロールでセクションをすすぐ。 注：キシレンは発癌性であり、それを使用する際に換気が実験室で必須である。その他製品が置き換えキシロールに存在するが、潜在的な再分析のために、より長い期間（数年、数十年）にわたってサンプルを記憶する意図がある場合には、カナダバルサム（ステップ3.5.2）が時間の経過とともに色を変化させずに透明なままでのみ包埋剤である。残念ながら、カナダバルサムはキシロールと組み合わせて使用​​する必要があります。 それは十分に脱水ない限りキシロールは（白っぽい）乳白色を回すように、脱水処理を繰り返します。 とすぐにキシロールを明確にとどまるように、100パーセントカナダバルサムの低下にセクションをカバーし、セクションの少なくとも大きさのカバーガラスでそれをカバーしています。 注：静かにカバーガラスを下に押して、気泡を除去することに注意してください。 耐熱性プラスチックの2のストリップ間に生じるマイクロスライドを置き、金属板の上に置きます。次の乾燥工程中に平坦部を維持するためにそれを下に押してスライドの上に（ 例えば 、磁石）の重量を配置します。 オーブン中でスライドを配置する約12時間60℃である。 12時間後、オーブンからスライドを取るし、それらをRT（約20℃）に冷却できるように棚の上に置きます。ときにクール、重量及びプラスチックストリップを削除し、余剰カナダバルサムを削除するにはかみそりの刃を使用してスライドをクリーニングします。 4.セルの内容を可視化 Nawashin液25を準備します。 クロム酸5gを、96％酢酸50mlおよび脱イオン水320mlの溶液（A）を調製する。の脱イオン水175ミリリットルとホルマリン200mlで別の溶液（B）を準備します。 Nawashinソリューションを作成するために1：1の比で溶液Aと溶液Bを混合する。 セルの内容を視覚化するために、セル内のすべての分解プロセスを停止し、10分間Nawashin溶液で試料を固定する。 注：;存在oを固定、細胞寿命（電池寿命=核存在/核不在の推定を可能にする細胞核を保持核のR不在）は、細胞が生きているか死んでいるかどうかを示します。 固定後、完全にサフラニンアストラブルーでそれらを染色する前に、さらにピクリン、アニリンブルー（1部飽和水溶性アニリン10％ピクリン酸4部+青）でそれらを染色しNawashin溶液を除去し、水で切片を洗浄。 慎重に染色処理を加速するために約80℃（沸点以下のいずれの場合において）に試料を加熱する。サンプルの脱水と埋め込むためのプロトコルは3.4から3.8の手順に従ってください。 5.解剖学的特徴のデジタル画像を準備する血管解析のためにコア表面のデジタル画像を作成します。 コアミクロトームを用いてコア表面平面を切断し、単にフェルトマーカーを用いて得られた表面の黒色を染色。 できるだけ早く染料が乾燥するように、白亜、コアの表面をこする。単に上のチョークをこすって細胞内のチョークを押す指を用いて表面。また、この手順によって余剰チョークを削除します。 注：細胞壁が黒色であり、血管の内腔の部分が白である結果。このコントラストは、自動画像解析のための前提条件である。 デジタルカメラを備えた双眼顕微鏡下に準備されたコアを配置します。わずか（約10％）の重複画像を全面が捕捉されるまで、コアの一方の側に起動シーケンスを取る。コア表面の完全なイメージを作成するために、単一の画像をステッチ。 マイクロスライドからデジタル画像を作成して顕微鏡下に洗浄マイクロスライドを置き、全体セクションから重複した画像を取る。 40Xおよび1,000倍の倍率の範囲、分析される構造に応じて特定の倍率を規定する。 セクションの1の完全な画像を作成するために、単一の画像をステッチ。綴じ処理中に可能な歪みを避けるために、「使用;計画「顕微鏡の対物レンズを-type。 6.解剖学的特徴の定量化画像解析ツールROXAS18または類似のソフトウェアを使用して細胞やリングの境界線を検出するために、メートル単位での定量的な結果を得るために、マイクロセクション及び関連する空間キャリブレーションの完全な画像をロードします。同じ倍率で撮影マイクロメートルのステージ画像のスケールの間のピクセル数を測定し、メートル法単位（ 例えば 1000μm以下）で、スケールの間隔によって得られた値で割ることによって空間較正を計算する。 （ソフトウェアで提供される）提供されたリストの分析の自動一部を開始する前に、適切な設定から選択します。 注：構成は、例えば、考慮のサンプルの染色の色、検出されるべき細胞のサイズおよび形状の範囲をとり、プログラム設定を以前に最適化されたセットである。こうして仕立ての構成異なる種と画質のための最適な認識結果を生成することを可能にする。 必要に応じて、試料中に回避するために含めたり除外されるイメージ内のような領域の使用量などのさらなるオプション、 例えば 、空白の画像の余白やクラックを選択します。 分析ボタンを押して分析を開始します。選択した場合、多角形、長方形や円ツールを使用して包含または除外される画像内の領域を定義。次の自動分析は、いくつかの画像の欠陥（ 例えば 、乏しいコントラスト）を補正し、画像の品質に基づいて、コントラストを向上させる柔軟なアルゴリズムを使用する。