Un punto di vista tecnico in Modern Tree-Ring Research - Come superare Dendroecological e legno anatomiche sfide
Summary
Here we present a protocol outlining how to sample wooden specimens for the overall assessment of their growth structures. Macro- and microscopic preparation and visualization techniques necessary to generate well-replicated and highly resolved wood anatomical and dendroecological dataset, are described are described.
Abstract
Ricerca Dendroecological usa le informazioni contenute negli anelli degli alberi per capire come singoli alberi e persino interi ecosistemi forestali hanno risposto ai cambiamenti ambientali e di ricostruire finalmente tali cambiamenti. Questo viene fatto attraverso l'analisi le variazioni di crescita nel tempo e correlare i vari parametri specifici vegetali (per esempio) i record di temperatura. Integrare legno parametri anatomici in queste analisi rafforzerebbe ricostruzioni, anche fino a risoluzione intra-annuale. Abbiamo quindi presentiamo un protocollo su come campione, preparare e analizzare campioni di legno per le analisi macroscopiche comuni, ma anche per le successive analisi al microscopio. Inoltre si introduce una potenziale soluzione per l'analisi di immagini digitali generate da piccole e grandi esemplari comuni per sostenere le analisi di serie temporali. Il protocollo presenta i passaggi di base in quanto attualmente possono essere usati. Oltre a questo, vi è una continua necessità per il miglioramento delle tecniche esistenti, e lo sviluppo di nuovi techniques, per registrare e quantificare i processi ambientali passati e in corso. Legno tradizionale ricerca anatomica deve essere ampliata per includere informazioni ecologiche di questo campo di ricerca. Ciò sosterrebbe dendro-scienziati che intendono analizzare nuovi parametri e sviluppare nuove metodologie per comprendere gli effetti a breve e lungo termine, dei fattori ambientali specifici sulla anatomia delle piante legnose.
Introduction
Alberi, così come arbusti, arbusti nani, e anche le erbe, mostrano modelli di risposta molteplici relativi ai cambiamenti nel loro ambiente. Questi modelli sono stati oggetto di botanica e fisiologia vegetale partire dalla metà del 19 ° secolo. Allora, la ricerca sulle piante legnose focalizzata soprattutto su alberi e un'analisi descrittiva della struttura e variabilità dei anelli annuali in un contesto ecologico 1. Quando Andrew Ellicott Douglass ha inventato la tecnica di cross-incontri per la ricerca degli anelli 2, tale contesto ecologico è stato più o meno represse dalla nuova possibilità di datare con precisione i risultati di legno in archeologia. Cross-incontri per la prima volta ha permesso la datazione precisa di anelli degli alberi per l'anno civile ed è fino ad ora considerata la spina dorsale della ricerca tree-ring in tutti i campi della sua applicazione 1.
In parallelo, a partire dalla fine del 19 ° secolo, in legno anatomia evoluta in un importante disciplina di ricerca riguardanod per molti altri campi delle scienze naturali e applicate 3. Sono stabiliti due domini principali: l'anatomia sistematica di legno, che è la base per identificare il legno in archeologia 4, e l'anatomia del legno applicata, legati alla tecnologia del legno, la fisiologia, la patologia, e l'ecologia 3,5.
Nella ricerca degli anelli degli alberi, dendroecologia oggi è definito come un tema che comprende studi albero anelli legati concentrandosi su studi ambientali come i processi geomorfologici (dendrogeomorphology), temperatura e ricostruzioni precipitazioni (Dendroclimatologia), i cambiamenti del livello dell'acqua (dendrohydrology) o anche le fluttuazioni dei ghiacciai ( dendroglaciology) 6. Poiché questa definizione indica, analisi albero-ring sono diventati sempre più importanti nel campo della datazione e di ricostruzione processi ambientali quali (i) le condizioni climatiche del passato analizzando variazioni annuali in anello larghezza 7,8, la densità del legno 9 o isotopi 10, o (ii) tha ricorrenza intervalli di processi geomorfologici 11. Questi studi molto dettagliati su variazioni anello larghezza e il loro contenuto isotopico dimostrano la necessità di analizzare anelli più in dettaglio, cioè, per studiare la struttura anatomica degli anelli. Tuttavia, studi dettagliati di legno caratteristiche anatomiche entro gli anelli annuali relativi ai cambiamenti ambientali sono rare 12,13. Anche se queste caratteristiche microscopiche sono noti 14, sono state raramente applicate a livello microscopico alla ricerca dendroecological. Inoltre, la tempistica accurata di queste reazioni di crescita in alberi cresciuti naturalmente, essenziali ai fini della esatta datazione, è stato raramente documentato di recente 15.
Per quanto riguarda gli effetti del riscaldamento globale 16, il miglioramento delle esistenti e lo sviluppo di nuove tecniche per registrare e quantificare processi ambientali passate e in corso è necessario, soprattutto in termini di clima di ricerca di impatto 11.Con l'espansione in legno ricerca anatomica tradizionale un'anatomia legno a base ecologica 17, dendro-scienziati possono analizzare nuovi parametri e sviluppare nuove metodologie per comprendere gli effetti a breve e lungo termine, dei fattori ambientali specifici sulla anatomia delle piante legnose 18. La conoscenza dettagliata sulle variazioni dei parametri cellulari diversi all'interno dei singoli anelli legati ai driver specifici (ad esempio, le forze meccaniche, variazioni climatiche) è il requisito fondamentale per la comprensione della variabilità in formazione anello albero. Rispetto alle misurazioni anello larghezza comuni, identificando legno varianti anatomiche richiede tecniche di preparazione più complesse e costose che richiedono molto lavoro e tempo. Le procedure dettagliate di taglio del campione, colorazione, e l'inclusione sono molteplici e dipendono sempre l'obiettivo dello studio 19.
Per l'analisi macroscopica di larghezza dell'anello in conifere o strutture, anche per numero, dimensioni o distribution di imbarcazioni in legno duro, la superficie di un campione è comunemente lucido utilizzando carta abrasiva fine o rettificatrici speciali 20. Uno svantaggio di questa procedura è il riempimento delle singole cellule con polvere che impedisce un'ulteriore semiautomatica analisi microscopica 21. I migliori risultati per la preparazione del campione macroscopico si ottengono quando la superficie del campione vengono tagliati con una lama di rasoio o un coltello affilato.
Mentre per i piccoli campioni, lamette sono uno strumento perfetto; campioni più grandi come core richiedono il taglio di superfici piane su tutta l'estensione del core. In contrasto levigatura, le cellule non sono riempite di polvere, che consente ulteriore preparazione per l'analisi dell'immagine successiva. Inoltre, il lume aperto cellulari, le pareti cellulari correttamente tagliate, e la superficie piana dell'intero campione consentono l'applicazione di alta frequenza 22 densitometria per tutta l'estensione del nucleo. Per un'immagine analisi, la superficie dei campioni (cellulepareti) possono essere colorati con inchiostro scuro e il lume celle aperte possono essere successivamente riempito con il gesso bianco per aumentare il contrasto tra la parete cellulare e la zona lume 19,23. Questo piuttosto semplice tecnica consente una valutazione macroscopica di base delle strutture cellulari più grandi per le misure di formato nave.
Queste tecniche di taglio superfici piane sono sufficienti per le analisi macroscopiche. Per una dettagliata anatomica in legno (cioè, microscopica) analisi, la microscopia a luce trasmessa è il metodo più comune applicata in scienze dendro. Xylem cellule differenziano attraverso processi complessi che comprendono tipo cellulare determinazione, la divisione cellulare, la differenziazione cellulare e la morte cellulare programmata 24. Poiché la sincronizzazione e la velocità con cui questi processi avvengono determinare caratteristiche anatomiche cellule, condizioni ambientali influenzano questi processi possono generare deviazioni anatomiche nella struttura ad anello. Come un presupposto importante per questi analizzares, micro sezioni devono essere preparati con un microtomo 19. Nel preparare campioni per il sezionamento, la visibilità del tracheidi o fibra direzione è cruciale. Si raccomanda l'uso di guidato microtomi scorrevole mano per tagliare micro sezioni perché questa tecnica facilita sezioni di alta qualità, come necessario per un'immagine analisi 19. A seconda dello scopo specifico di un certo studio, micro sezioni sono tagliate perpendicolare o parallelo alla estensione longitudinale delle cellule. Queste sezioni sono poi fotografati sotto un microscopio e le dimensioni delle celle misurate utilizzando l'immagine specializzata analisi software.
Fino a poco tempo, la possibilità di preparare micro sezioni era limitata a campioni di piccole dimensioni solo (circa 1 cm x 1 cm). Questo è accettabile per analizzare singoli eventi come disturbi in anni specifici, ma questa tecnica non permette l'analisi di serie tempo necessario per ricostruzioni ambientali. Questo sforzo può essere realizzare solod attraverso lo sviluppo di nuovi, efficienti ed economiche le procedure di preparazione e tecniche analitiche. Negli ultimi anni, i membri del laboratorio albero-ring al Swiss WSL Istituto federale di ricerca in Svizzera hanno iniziato un intenso lavoro su questo argomento. Come risultato, nuovi dispositivi e tecniche di analisi sono state sviluppate per sostenere l'idea di integrare legno caratteristiche anatomiche a una vasta gamma di argomenti di ricerca ambientali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le sfide di una integrazione riuscita e sostenibile del legno anatomia in ricerca dendroecological sono, oltre a problemi analitici molteplici, soprattutto a causa di aspetti tecnici. Queste sfide vanno dal principio di campionamento si avvicina alla creazione di micro sezioni di alta qualità e la loro successiva analisi 19.
A prima vista, il campionamento di anime o anche dischi è una procedura semplice che è stato conosciuto per molti anni. Ci sono molte cose che si possono fare male e una piccola imprecisione nel campionamento può causare gravi problemi durante le successive fasi di preparazione e di analisi. Piccole imprecisioni come carotaggio che non è esattamente perpendicolare all'asse del fusto o utilizzando un corer imperfettamente affilata non sono un problema se l'obiettivo dello studio è limitato a suonare larghezza misurazioni. Tuttavia, quando si mira per l'analisi microscopica dei campioni, una direzione di campionamento non corretta potrebbe causare distorsioni ottiche dipareti cellulari, mentre l'uso di contundenti defittonatrici risultati in microfratture all'interno del nucleo. Come risultato, quando si cerca di tagliare micro sezioni di questi nuclei, sezioni sottili appena scompone e una preparazione efficace non è garantita. Lo stesso vale per il campionamento micro-core. Una punta smussata si tradurrà in alta pressione quando il nemico viene martellato nel legno stelo. Di conseguenza, verrà compressa lo strato cambiale. Le cellule cambiale (Figura 5) sono quindi compressi e non possono essere analizzati.
Campionamento Disc è davvero la migliore strategia quando si analizzano le variazioni di crescita per loro si riferiscono ai cambiamenti ambientali. Purtroppo è semplicemente impossibile prendere i dischi da tutti gli alberi destinati ad essere campioni per ulteriori analisi. Tuttavia, soprattutto nel caso di dendrochronology tropicale, una certa quantità di dischi staminali è necessaria in combinazione con nuclei di incremento. I dischi sono utilizzati come base per definire i confini anello e per questo per supportare boundarIES definite sulla base di analisi di carote di incremento 12,27,28.
I pro ei contro di levigatura contro taglio sono spesso discussi 1,11,21. Come si è menzionato sopra, la procedura migliore dipende sempre dalla domanda di ricerca ed i parametri da analizzare (macroscopica e microscopica). Se le analisi isotopiche o chimici sono proiettati in un ulteriore passo avanti di lavoro, è della massima importanza che la polvere abrasiva creato da levigatura che può riempire in lumina cellulare su tutto il campione, viene accuratamente rimosso con un aspirapolvere o pressione atmosferica.
Taglio micro sezioni è per tutti microscopica analizza il modo più appropriato di preparazione dei campioni per ulteriori analisi. Prima di tutto, la sezione viene tagliato il campione, che poi può essere mantenuta senza alcuna contaminazione potenziali ulteriori analisi. Secondo queste sezioni consentono di misure ad alta risoluzione dei parametri di cella singola. Inoltre, evitando l'incorporamento tempotecnica utilizzando una soluzione di amido di mais 26 per stabilizzare le cellule è un grande vantaggio in micro sezionamento.
Uno svantaggio di micro sezionamento è ancora la dimensione del campione limitato conseguente lunghi tempi di preparazione. Per la serie in tempo reale analisi tornare indietro nel tempo nel corso dei secoli o addirittura millenni, vi è la necessità di sviluppare ulteriormente i dispositivi esistenti taglio 17,19, ma anche l'elaborazione delle immagini e analisi 18. Un primo passo in questa direzione è lo sviluppo del microtomo nucleo 21, inizialmente fabbricati tagliare superfici piane su carote (Figura 1). Prove recenti hanno rivelato la possibilità di tagliare micro sezioni di interi nuclei utilizzando questo dispositivo (Figura 1).
Micro sezioni di alta qualità forniscono il principio di base per un'analisi efficace immagine. Prendendo le immagini al microscopio è una procedura comune 19, ma la loro analisi efficace è ancora un compito che richiedeessere ulteriormente sviluppati 17. Tutti i sistemi di analisi di immagine esistenti sono semi-automatico, cioè, hanno bisogno di essere più o meno intensamente controllato dal tecnico. In molti casi, le immagini devono essere corretti o anche nuove immagini devono essere fatto per migliorare il contrasto per una migliore registrazione di strutture dal software senza modificare lo spessore della parete cellulare all'interno dell'immagine.
Strumenti di analisi dell'immagine specializzati quali ROXAS 18, WinCell o script specifici per ImageJ 29 sono in grado di fornire i dati anatomici di base, quali il numero di cellule, la dimensione delle cellule, lo spessore della parete cellulare e la posizione delle cellule all'interno dell'anello annuale. Molti parametri anatomici supplementari che sono rilevanti in un contesto dendroecological possono essere calcolate da queste misurazioni di base come la dimensione dei maggiori condotti, distribuzione delle dimensioni dei condotti, dimensione primaticcio o la prima fila di condotti, (ottica) densità del legno, intra-annuale profili di dimensioni condotto e la parete cellularedi spessore, e modelli di raggruppamento di tubazioni (solitario, multipli, ecc).
Utilizzando il software ROXAS 18, i contorni di lumina condotto (cioè acqua cellule conduzione) e confini anello annuali vengono riconosciuti automaticamente e visivamente rappresentate come overlay sopra l'immagine originale. Algoritmi di rilevamento per tubi sono basati sul colore, la dimensione e la forma informazioni, algoritmi di rilevamento per le frontiere anello sul contesto locale di ogni conduttore. Una cassetta degli attrezzi ci permette di migliorare manualmente questi risultati modificando direttamente le caratteristiche di sovrapposizione, cioè, la cancellazione, l'aggiunta e la modifica dei confini anello e condotto contorni. Dopo la modifica, l'output finale dei dati, tra cui spessore della parete cellulare (conifere), viene generato automaticamente e salvati in un foglio di calcolo. Completamente sistemi automatici non sono attualmente disponibili, non anche per le conifere mostrano una struttura relativamente semplice, ma questo è un obiettivo per gli sviluppi futuri. Ciò sostenere con forza la fuintegrazione ll di legno parametri anatomici in serie temporali di analisi.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the effort of Sandro Lucchinetti (Schenkung Dapples, Zürich) for constructing the devices needed to guarantee progress in sample preparation.
Materials
| Increment corer | http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article &id=57&Itemid=88&lang=en |
||
| Core-Microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
| Laboratory microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
| Trephor micro corer | http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp | ||
| Nawashin solution | Ten parts 1% chromic acid, four parts 4% formaldehyde and one part acetic acid | ||
| Picric-Anilin blue | One part saturated aniline blue and four parts Trinitrophenol dissolved in 95% ethanol | ||
| Safranin | Empirical Formula (Hill Notation) C20H19ClN4 | ||
| Astra-blue | Empirical Formula (Hill Notation) C47H52CuN14O6S3 | ||
| Ethanol | Linear Formula CH3CH2OH | ||
| Xylol (Xylene) | Linear Formula C6H4(CH3)2 | ||
| Canada Balsam | Embedding solution for microscopy | ||
| Roxas Software | http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN | ||
| ImageJ Software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| WinCell | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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