פרספקטיבה טכנית במחקר העץ-טבעת מודרנית - כיצד להתגבר על Dendroecological ואתגרי אנטומי עץ
Summary
Here we present a protocol outlining how to sample wooden specimens for the overall assessment of their growth structures. Macro- and microscopic preparation and visualization techniques necessary to generate well-replicated and highly resolved wood anatomical and dendroecological dataset, are described are described.
Abstract
מחקר Dendroecological משתמש במידע המאוחסן בטבעות עץ להבין איך עצים בודדים ואפילו מערכות אקולוגיות יער כולו הגיבו לשינויים סביבתיים ולבסוף לשחזר שינויים כאלה. הדבר נעשה על ידי ניתוח וריאציות צמיחה אחורה בזמן ומקשרים פרמטרים מפעל ספציפי שונים לרשומות (לדוגמא) בטמפרטורה. שילוב פרמטרים אנטומיים עץ בניתוחים אלו יחזקו שחזורים, אפילו עד להחלטת הפנים-שנתית. לפיכך, אנו מציגים פרוטוקול על איך לטעום, להכין, ולנתח דגימה מעץ לניתוחים מקרוסקופית משותפים, אלא גם עבור ניתוחים מיקרוסקופיים שלאחר מכן. יתר על כן אנחנו מציגים פתרון אפשרי לניתוח תמונות דיגיטליות שנוצרו מדגימות קטנות וגדולות משותפות לתמיכה בזמן סדרת ניתוחים. הפרוטוקול מציג את השלבים הבסיסיים כפי שהם כיום ניתן להשתמש. מעבר לכך, יש צורך מתמשך לשיפור טכניקות קיימות, ופיתוח של t החדשechniques, להקליט ולכמת תהליכים סביבתיים בעבר ובמתמשך. מחקר אנטומי עץ מסורתי צריך להיות מורחב כדי לכלול מידע אקולוגי לתחום זה של מחקר. זה יתמוך Dendro-מדענים שמתכוונים לנתח פרמטרים חדשים ולפתח שיטות חדשות כדי להבין את ההשפעות לטווח קצרות וארוכות של גורמים סביבתיים ספציפיים על האנטומיה של צמחים עציים.
Introduction
עצים, כמו גם שיחים, שיחים ננסיים, ואפילו עשבי תיבול, להראות דפוסי תגובת סעפת קשורים לשינויים בסביבה שלהם. דפוסים אלה היו כפופים לבוטניקה ופיזיולוגיה של צמח מאז אמצע המאה ה 19. אז, מחקר על צמחים עציים התמקד בעיקר בעצים וניתוח תיאורים של המבנה והשונה של טבעות שנתיות בהקשר אקולוגי 1. כאשר אנדרו Ellicott דאגלס המציא את טכניקת היכרויות הצולבות לעץ-טבעת מחקר 2, הקשר אקולוגי זה היה פחות או יותר דוכא על ידי היכולת החדשה לתאריך מדויק ממצאי עץ בארכיאולוגיה. צלב-היכרויות בפעם הראשונה אפשרו התארוך מדויק של טבעות עץ לשנה קלנדרית ועד עכשיו נחשבות כעמוד השדרה של מחקר עץ-טבעת בכל תחומי יישומה 1.
במקביל, מאז סוף המאה ה -19, האנטומיה העץ התפתחה לדיסציפלינה מחקרית חשובה להתייחסד לתחומים רבים אחרים של מדעי טבע והוחלו 3. שני תחומים עיקריים שהוקמו: אנטומיה השיטתית עץ, אשר מהווה את הבסיס לזיהוי עץ בארכיאולוגיה 4, ואת האנטומיה העץ מיושמת, הקשורים לטכנולוגית עץ, פיזיולוגיה, פתולוגיה, ואקולוגיה 3.5.
במחקר עץ-טבעת, dendroecology כיום מוגדר כנושא הכולל מחקרי עץ-טבעת קשורה מתמקדים במחקרים סביבתיים כגון תהליכי geomorphic (dendrogeomorphology), טמפרטורה ושחזורי ממטרים (dendroclimatology), שינויי מפלס מים (dendrohydrology) או אפילו תנודות קרחון ( dendroglaciology) 6. כהגדרה זו מציינת, ניתוחי עץ-טבעת הפכו חשובים יותר ויותר בתחום היכרויות ושחזור תהליכים סביבתיים כגון (i) תנאי אקלים בעבר על ידי ניתוח שינויים שנתי בטבעת-רוחב 7,8, עץ צפיפות 9 או 10 איזוטופים, או (Ii) tהוא להשנות מרווחים של תהליכי geomorphic 11. מחקרים מפורטים מאוד על אלה וריאציות טבעת רוחב והתוכן האיזוטופי שלהם להפגין את הצורך לנתח טבעות בפירוט רב יותר, כלומר, כדי ללמוד את המבנה האנטומי של הטבעות. עם זאת, מחקרים מפורטים של תכונות אנטומיים עץ בתוך הטבעות השנתיות הקשורים לשינויים סביבתיים הם נדירים 12,13. למרות שידועות בתכונות המיקרוסקופיות אלה 14, יש להם רק לעתים נדירות יושמו ברמה מיקרוסקופית למחקר dendroecological. יתר על כן, התזמון מדויק של תגובות צמיחה אלה בעצים גדלו באופן טבעי, חיוניים למטרות היכרויות מדויקות, כמעט ולא תעד לאחרונה 15.
לגבי ההשפעות של התחממות כדור הארץ 16, השיפור של קיים ופיתוח של טכניקות חדשות כדי להקליט ולכמת תהליכים סביבתיים בעבר ובמתמשך נדרש, במיוחד במונחים של מחקר השפעת האקלים 11.על ידי הרחבת מחקר אנטומי עץ מסורתי לאנטומיה עץ מבוסס מבחינה אקולוגית 17, Dendro-מדענים יכולים לנתח פרמטרים חדשים ולפתח שיטות חדשות כדי להבין את ההשפעות קצרות טווח וארוך טווח של גורמים סביבתיים ספציפיים על האנטומיה של צמחים עציים 18. ידע מפורט על שינויים בפרמטרים שונים בתוך תא טבעות בודדות הקשורים לנהגים מסוימים (לדוגמא, כוחות מכאניים, וריאציות אקלים) הוא הדרישה הבסיסית להבנה השונות בהיווצרות טבעת עץ. בהשוואה למדידות טבעת-רוחב נפוצה, זיהוי וריאציות אנטומיים עץ דורש טכניקות הכנה מורכבות יותר ורחבה שדורשות הרבה עבודה וזמן. נהלים מפורטים של חיתוך מדגם, צביעה, והטבעה הם מגוונים והם תמיד תלויים במטרה של המחקר 19.
לניתוח מקרוסקופית של רוחב טבעת בעצי מחט או מבנים אפילו למספר, גודל או distribution כלי מעץ קשה ב, את פני השטח של מדגם נפוץ מלוטש באמצעות נייר מחוספס קנס או מכונות ליטוש מיוחד 20. חסרון של שיטה זו הוא במילוי של התאים הבודדים עם אבק שמונע ניתוח מיקרוסקופי חצי אוטומטי נוסף 21. התוצאות הטובות ביותר עבור הכנת מדגם מקרוסקופית מושגות כאשר פני השטח מדגם נחתכים באמצעות סכין גילוח או אחר סכין חד.
ואילו עבור מדגמים קטנים, סכיני גילוח הם כלי מושלם; דגימות גדולות יותר כליבות דורשות החיתוך של משטחי מטוס על פני כל ליבות המידה. בניגוד למלטש, התאים אינם מלאים באבק, המאפשר הכנה נוספת לניתוח תמונה רצוף. יתר על כן, לומן הפתוח התא, קירות התא לחתוך כראוי, ועל פני השטח המטוס מכלל המדגם לאפשר היישום של צפיפות בתדירות גבוהה 22 לכל ליבת המידה. לתמונת ניתוחים, את פני השטח של דגימות (תאקירות) יכולים להיות מוכתמים באמצעות דיו כהה ולאחר מכן ניתן יהיה לבצע את לומן התא הפתוח עם גיר לבן על מנת לשפר את הניגוד שבין דופן התא ואזור הלום 19,23. טכניקה פשוטה למדי זה מאפשרת הערכה מקרוסקופית בסיסית של מבני תא גדולים יותר למדידות גודל כלי דם.
טכניקות אלה לחיתוך משטחי מטוס מספיקות לניתוחים מקרוסקופיים. לאנטומיים עץ מפורט ניתוח (כלומר, מיקרוסקופי), מיקרוסקופ אור מועברת היא השיטה הנפוצה ביותר שיושמה במדעי Dendro. תאי עצה להבחין בתהליכים מורכבים הכוללים קביעת סוג התא, חלוקת תא, התמיינות תאים, ולתכנת תאי מוות 24. מאז התזמון והקצב שבו תהליכים אלה מתרחשים לקבוע מאפיינים אנטומיים תא, תנאים סביבתיים המשפיעים על תהליכים אלה יכולים ליצור סטיות אנטומיים במבנה הטבעת. כתנאי חשוב לאלה לנתחים, קטעי מיקרו צריך להיות מוכנים עם 19 microtome. בעת הכנת דגימות עבור חתך, את הנראות של כיוון tracheid או סיבים היא קריטיות. השימוש ביד מונעת החלקת microtomes מומלץ לחתוך קטעי מיקרו כי טכניקה זו מאפשרת חלקים באיכות גבוהה בהתאם לצורך לתמונה מנתח 19. בהתאם למטרה הספציפית של מחקר מסוים, קטעי מיקרו נחתכים בניצב או מקביל במידת האורך של התאים. אז סעיפים אלה מצולמים מתחת למיקרוסקופ וממדים תא נמדדו באמצעות תמונה מיוחדת מנתחים תוכנה.
עד לאחרונה, את היכולת להכין קטעי מיקרו הוגבלה לגודל מדגם קטן (כ 1 סנטימטר x 1 סנטימטר) בלבד. זה מקובל לנתח אירועים בודדים כמו הפרעות בשנים מסוימות, אבל טכניקה זו אינה מאפשרת ניתוח סדרת הזמן הממושך הנדרש לשחזורים סביבתיים. מאמץ זה יכול להיות רק להביןד באמצעות הפיתוח של נהלי הכנה חדשים, יעילים וכלכליים ושיטות אנליטיות. בשנים האחרונות, אנשי המעבדה עץ-הטבעת בWSL מכון המחקר השוויצרי הפדרלי בשוויץ החלו עבודה אינטנסיבית בנושא זה. כתוצאה מכך, מכשירים חדשים וטכניקות ניתוח פותחו כדי לתמוך ברעיון של שילוב תכונות אנטומיים עץ למגוון רחב של נושאי מחקר סביבתיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
האתגרים של שילוב מוצלח ובר קיימא של האנטומיה עץ למחקר dendroecological הם, מלבד בעיות אנליטיות סעפת, בעיקר בשל היבטים טכניים. אתגרים אלה נעים בין דגימת עיקרון גישות ליצירת קטעי מיקרו באיכות גבוהה והניתוח שלאחר מכן 19.
במבט הראשון, הדגימה של ליבות או אפילו דיסקים היא תהליך פשוט, כי כבר ידוע כבר שנים רבות. יש הרבה דברים שאפשר לעשות לא נכון וחוסר דיוק קטן בדגימה יכול לגרום לבעיות חמורות בשלבי ההכנה וניתוח שלאחר מכן. אי דיוקים קטנים כגון coring שהוא לא בדיוק בניצב לציר הגזע או לשימוש corer חידד מושלם הם לא בעיה, אם המטרה של המחקר מוגבל לתצלצל רוחב מדידות. עם זאת, כאשר מכוונים לניתוח מיקרוסקופי של הדגימות, כיוון דגימה שגוי עלול לגרום לעיוותים אופטיות שלקירות תא, ואילו השימוש בתוצאות corers בוטות בסדקי מיקרו בתוך הליבה. כתוצאה מכך, כאשר מנסים לחתוך קטעי מיקרו של ליבות אלה, החלקים הדקים פשוט מתפרקים והכנה יעילה היא כבר לא מובטחת. הדבר נכון גם עבור דגימת מיקרו-ליבה. קצה קהה יגרום לחץ גבוה כאשר אגרופן הוא שהוחדר לתוך עץ הגזע. כתוצאה מכך שכבת cambial תהיה דחוסה. תאי cambial (איור 5) וכתוצאה מכך הם לחץ ולא ניתן לנתח.
דגימת דיסק היא אכן האסטרטגיה הטובה ביותר בעת ניתוח וריאציות צמיחה להתייחס לשינויים סביבתיים. למרבה הצער זה פשוט בלתי אפשרי לקחת דיסקים מכל העצים המיועדים לנדגמו לניתוח נוסף. אף על פי כן, במיוחד במקרה של מדעי זה נקרא דנדרוכרונולוגיה הטרופית, כמות מסוימת של דיסקי גזע יש צורך בשילוב עם ליבות תוספת. הדיסקים משמשים כבסיס להגדרת גבולות טבעת ולכך לתמוך בboundaries הוגדר על בסיס ניתוח ליבות תוספת 12,27,28.
היתרונות והחסרונות של מלטש לעומת חיתוך לעתים קרובות דנו 1,11,21. כפי שהוזכר לעיל, ההליך הטוב ביותר תמיד תלוי בשאלת המחקר והפרמטרים כדי להיות מנותחים (מקרוסקופית או מיקרוסקופיים). אם ניתוח איזוטופי או כימי מוקרן בשלב עבודה נוספת, זה הוא בעל חשיבות עליונה שהאבק שוחק נוצר על ידי מלטש שעשוי למלא לתוך תא ומינה על כל המדגם, הוא הסיר בזהירות על ידי שאיבת אבק או אוויר בלחץ.
חיתוך קטעי מיקרו הוא לכל מיקרוסקופי מנתח את הדרך המתאימה ביותר להכנת דגימות לניתוח נוסף. קודם כל, הסעיף מנותק המדגם, אז מה שיכול להישמר ללא זיהום כלשהו לניתוח נוסף פוטנציאלי. שנית סעיפים אלה מאפשרים למדידות ברזולוציה גבוהות של פרמטרים תא בודדים. יתר על כן, הימנעות הטבעת זמן רבטכניקה באמצעות פתרון קורנפלור 26 כדי לייצב את התאים היא יתרון גדול בחתך מיקרו.
חסרון של חתך מיקרו הוא עדיין גודל המדגם המוגבל וכתוצאה מכך פעמים הכנה ארוכות. לסדרת ניתוחים בזמן אמת הולכת אחורה בזמן במשך מאות או אפילו אלף שנים, יש צורך בפיתוח נוסף מכשירים קיימים חיתוך 17,19, אלא גם עיבוד תמונה וניתוח 18. צעד ראשון לכיוון זה הוא הפיתוח של microtome הליבה 21, תחילת דרך ייצר לחתוך משטחי מטוס על ליבות (איור 1). הבדיקות האחרונות חשפו את היכולת לחתוך קטעי מיקרו של ליבות כל שימוש במכשיר זה (איור 1).
קטעי מיקרו באיכות גבוהה לספק את העיקרון הבסיסי לניתוח תמונה יעיל. אם ניקח את התמונות תחת מיקרוסקופ הוא הליך נפוץ 19, אבל הניתוח האפקטיבי שלהם הוא עדיין משימה שצריכהלהיות מפותח נוסף 17. כל מערכות ניתוח התמונה הקיימות הן חצי אוטומטיות, כלומר, הם צריכים להיות פחות או יותר בשליטה בעוצמה על ידי הטכנאי. במקרים רבים, את התמונות צריכים להיות מתוקנות או אפילו תמונות חדשות צריכים להיעשות כדי לשפר בניגוד לרישום טוב יותר של המבנים על ידי התוכנה מבלי לשנות דופן תא עובי בתוך התמונה.
כלי ניתוח תמונה מיוחדים כגון 18 רוחס, WinCell או סקריפטים ספציפיים לImageJ 29 מסוגלים לספק נתונים אנטומיים בסיסיים כמו מספר תא, ממד תא, דופן תא עובי ומיקום תא בתוך הטבעת השנתית. מדדים אנטומיים רבים נוספים שרלוונטיים בהקשר dendroecological ניתן לחשב ממדידות הבסיסיות אלה כגון גודל של הצינורות הגדולים, התפלגות גודל של צינורות, גודל earlywood או השורה הראשונה של צינורות, צפיפות עץ (אופטית), תוך שנתית פרופילים של גודל צינור וקיר תאעובי, ודפוסים של צינורות (בודדים, כפולות, וכו ') קיבוץ.
שימוש בתוכנה רוחס 18, את קווי המתאר של ומינה צינור (כלומר, תא ניצוח מים) וגבולות טבעת שנתיות מזוהים אוטומטי וחזותיים מיוצגים כשכבות על התמונה המקורית. אלגוריתמים לזיהוי לצינורות מבוססים על צבע, גודל וצורת מידע, אלגוריתמים לזיהוי לגבולות טבעת בהקשר המקומי של כל צינור. ארגז כלים מאפשר לנו לשפר באופן ידני את התוצאות הללו ישירות על ידי עריכת התכונות של השכבות, כלומר, מחיקה, הוספה ושינוי גבולות טבעת והצינור מתאר. לאחר עריכה, הפלט הסופי הנתונים, כוללים תא קיר עובי (עצי מחט), נוצר באופן אוטומטי והציל לגיליון אלקטרוני. באופן מלא מערכות אוטומטיות אינם זמינות כרגע, אפילו לא לעצי מחט מראה מבנה פשוט יחסית, אבל זה מטרה להתפתחויות עתידיות. זה הייתי מאוד תומך בפושילוב ll פרמטרים אנטומיים עץ סדרת זמן בניתוחים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the effort of Sandro Lucchinetti (Schenkung Dapples, Zürich) for constructing the devices needed to guarantee progress in sample preparation.
Materials
| Increment corer | http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article &id=57&Itemid=88&lang=en |
||
| Core-Microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
| Laboratory microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
| Trephor micro corer | http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp | ||
| Nawashin solution | Ten parts 1% chromic acid, four parts 4% formaldehyde and one part acetic acid | ||
| Picric-Anilin blue | One part saturated aniline blue and four parts Trinitrophenol dissolved in 95% ethanol | ||
| Safranin | Empirical Formula (Hill Notation) C20H19ClN4 | ||
| Astra-blue | Empirical Formula (Hill Notation) C47H52CuN14O6S3 | ||
| Ethanol | Linear Formula CH3CH2OH | ||
| Xylol (Xylene) | Linear Formula C6H4(CH3)2 | ||
| Canada Balsam | Embedding solution for microscopy | ||
| Roxas Software | http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN | ||
| ImageJ Software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| WinCell | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Schweingruber, F. H. . Tree Rings and Environment: Dendroecology. , (1996).
- Sheppard, P. R. Dendroclimatology: extracting climate from trees. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 1, 343-352 (2010).
- Wagenführ, R. . Anatomie des Holzes: Strukturanalytik – Identifizierung – Nomenklatur – Mikrotechnologie. , (1999).
- Tennessen, D., Blanchette, R. A., Windes, T. C. Differentiating Aspen and Cottonwood in Prehistoric Wood from Chacoan Great House Ruins. Journal of Archaeological Science. 29, 521-527 (2002).
- Rowell, R. M. . Handbook of Wood Chemistry and Wood Composites. , (2005).
- Kaennel, M., Schweingruber, F. H. . Multilingual Glossary of Dendrochronology. Terms and definitions in English, German, French, Spanish, Italian, Portuguese and Russian. , (1995).
- Esper, J., Frank, D. C., Luterbacher, J., Kienast, F., et al. A changing world: challenges for landscape research. On selected issues and challenges in dendroclimatology. , 113-132 (2007).
- Esper, J., Frank, D. C., Wilson, R. J. S., Büntgen, U., Treydte, K. Uniform growth trends among central Asian low and high elevation juniper tree sites. Trees. 21 (2), 141-150 (2007).
- Frank, D. C., Nievergelt, D., Esper, J. Summer temperature variations in the European Alps, AD 755-2004. Journal of Climate. 19 (2), 5606-5623 (2006).
- Treydte, K., et al. Millennium-long precipitation record from tree-ring oxygen isotopes in northern Pakistan. Nature. 440, 1179-1182 (2006).
- Heinrich, I., Elias, S. A. Dendrogeomorphology. The Encyclopedia of Quaternary Science. 2, 91-103 (2013).
- Verheyden, A., De Ridder, F., Schmitz, N., Beeckman, H., Koedam, N. High-resolution time series of vessel density in Kenyan mangrove trees reveal a link with climate). New Phytologist. 167, 425-435 (2005).
- Abrantes, J., Campelo, F., García-González, I., Nabais, C. Environmental control of vessel traits in Quercus ilex under Mediterranean climate: relating xylem anatomy to function. Trees. 27, 655-662 (2013).
- Fengel, D., Wegener, G. W. o. o. d. . Wood: Chemistry, Ultrastructure, Reactions. , (2003).
- Heinrich, I., Gärtner, H., Monbaron, M. Tension wood formed in Fagus sylvatica and Alnus glutinosa after simulated mass movement events. IAWA-Journal. 28 (1), 39-48 (2007).
- Stocker, T. F., et al. Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , (2013).
- Lucchinetti, S., Schweingruber, F. H. New perspectives for wood anatomical analysis in Dendrosciences: The GSL1-microtome). Dendrochronologia. 32 (1), 47-51 (2014).
- Arx, G., Carrer, M. ROXAS – a new tool to build centuries-long tracheid-lumen chronologies in conifers. Dendrochronologia. 32 (3), 290-293 (2014).
- Schweingruber, F. H. . Microscopic Preparation Techniques for Plant Stem Analysis. , (2013).
- Hoadley, R. B. . Identifying wood: Accurate results with simple tools. , (1990).
- Nievergelt, D. The core-microtome. A new tool for surface preparation on cores and time series analysis of varying cell parameters. Dendrochronologia. 28 (2), 85-92 (2010).
- Von Schnakenburg, P., Bräuning, A., Helle, G., Elferts, D., Brumelis, G., Gärtner, H., Helle, G., Schleser, G. Detecting annual growth rhythms from high-frequency densitometry and carbon isotopes in tropical mountain rain forest trees in southern Ecuador. Tree Rings in Archaeology, Climatology and Ecology. 6, 96-99 (2008).
- Garcia Gonzalez, I., Fonti, P. Ensuring a representative sample of earlywood vessels for dendroecological studies: an example from two ring-porous species. Trees. 22 (2), 237-244 (2008).
- Fonti, P., et al. Studying global change through plastic responses of xylem anatomy in tree rings. New Phytologist. 185 (1), 42-53 (2010).
- Purvis, M. J., Collier, D. C., Walls, D. . Laboratory techniques in Botany. , (1966).
- Schneider, L., Gärtner, H. The advantage of using non-Newtonian fluids to prepare micro sections. Dendrochronologia. 31 (3), 175-178 (2013).
- De Ridder, M., Vanden Bulcke, J., Van Ackera, J., Beeckman, H. Tree-ring analysis of an African long-lived pioneer species as a tool for sustainable forest management. Forest Ecology and Management. 304, 417-426 (2013).
- De Ridder, M., et al. A tree-ring based comparison of Terminalia superba climate–growth relationships in West and Central. Trees. 27 (5), 1225-1238 (2013).
- Redband, W. S. . ImageJ. , (1997).
