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Environment

Technischer Sicht in Modern Jahrringforschung - Wie Dendroökologische und Holz anatomische Herausforderungen zu meistern

Published: March 05, 2015
doi:
10.3791/52337
, , , , , , , , ,
1Landscape Dynamics / Dendroecology,Swiss Federal Research Institute WSL

Summary

Here we present a protocol outlining how to sample wooden specimens for the overall assessment of their growth structures. Macro- and microscopic preparation and visualization techniques necessary to generate well-replicated and highly resolved wood anatomical and dendroecological dataset, are described are described.

Abstract

Dendroökologische Forschung verwendet Informationen in Baumringen gelagert, um zu verstehen, wie einzelne Bäume und ganze Waldökosysteme reagiert auf Veränderungen der Umwelt und schließlich zu rekonstruieren solche Änderungen. Dies wird durch die Analyse von Wachstums Variationen in der Zeit zurück und Korrelieren verschiedener anlagenspezifische Parameter (zum Beispiel) Temperatur-Aufzeichnungen gemacht. Die Integration von holzanatomische Parameter in diesen Analysen würden Rekonstruktionen zu stärken, bis hin zu innerJahresAuflösung. Wir stellen daher ein Protokoll auf, wie man für die anschließende mikroskopische Analysen probieren, vorzubereiten und zu analysieren Holzprobe für die gemeinsame makroskopischen Analysen, aber auch. Darüber hinaus stellen wir eine mögliche Lösung für die Analyse von digitalen Bildern von gemeinsamen kleinen und großen Proben erzeugt werden, um zu unterstützen Zeitreihenanalysen. Das Protokoll stellt die grundlegenden Schritte, wie sie derzeit verwendet werden. Darüber hinaus gibt es einen anhaltenden Bedarf zur Verbesserung der bestehenden Techniken, und die Entwicklung neuer techniques, zu erfassen und zu quantifizieren, vergangene und laufende Umweltprozesse. Traditionelle Holz anatomische Forschung muss erweitert werden, um ökologische Hinweise zu diesem Forschungsgebiet gehören. Dies würde Dendro-Wissenschaftler, die neuen Parameter zu analysieren und entwickeln neue Methoden, um die kurz- und langfristigen Auswirkungen von bestimmten Umweltfaktoren auf die Anatomie der holzigen Pflanzen zu verstehen, die Absicht zu unterstützen.

Introduction

Bäume sowie Sträucher, Zwergsträuchern und sogar Kräuter, zeigen vielfältige Reaktionsmuster auf Veränderungen in ihrer Umwelt. Diese Muster wurden seit der Mitte des 19. Jahrhunderts unter der Botanik und Pflanzenphysiologie. Damals Forschung verholzte Pflanzen meist auf Bäumen und einem beschreibenden Analyse der Struktur und Variabilität der Jahresringe in einem ökologischen Kontext ein. Als Andrew Ellicott Douglass erfand die Querdatierungstechnik für Ringforschung 2 wurde dieser ökologischen Kontext mehr oder weniger durch die neue Fähigkeit, genau zu datieren Holz Erkenntnisse der Archäologie unterdrückt. Übergreifende aus zum ersten Mal ermöglichte die genaue Datierung von Baumringen mit dem Kalenderjahr und wird bis heute als das Rückgrat der Jahrringforschung in allen Bereichen seiner Anwendung 1 angesehen.

Parallel dazu seit Ende des 19. Jahrhunderts, Holzanatomie zu einem wichtigen Forschungsdisziplin entwickelt beziehend zu vielen anderen Gebieten der Naturwissenschaften und angewandte Wissenschaften 3. Zwei Hauptbereiche etabliert: die systematische Holzanatomie, die die Grundlage für die Identifizierung Holz in der Archäologie 4 ist, und die aufgebrachte Holzanatomie, auf Holztechnik, Physiologie, Pathologie und Ökologie 3,5 zusammen.

In Jahrringforschung, Dendroökologie heute als Thema definiert umfassende Jahrringbezogene Untersuchungen zu den Umweltstudien wie geomorphologischen Prozessen (Dendrogeomorphologie), Temperatur- und Niederschlagsrekonstruktionen (Dendroklimatologie), Wasserstandsänderungen (Dendrohydrologie) oder sogar Gletscherschwankungen ( Dendroglaziologie) 6. Da diese Definition zeigt, haben Jahrringanalysen werden im Bereich der Datierung und Rekonstruktion von Umweltprozessen immer wichtiger, wie (i) Vergangenheit klimatischen Bedingungen durch die Analyse von jährlichen Schwankungen in Ringbreite 7,8, Holzdichte 9 oder Isotope 10 oder (ich ser Rezidiv Abständen von geomorphologischen Prozessen 11. Diese sehr detaillierte Studien über Ringbreitenschwankungen und deren Isotopengehalt zeigen die Notwendigkeit, Ringe näher, also zu analysieren, um die anatomische Struktur der Ringe zu studieren. Allerdings sind detaillierte Studien aus Holz anatomische Merkmale im Rahmen der Jahresringe auf Veränderungen der Umwelt im Zusammenhang selten 12,13. Obwohl diese mikroskopische Merkmale bekannt sind 14, haben sie nur selten auf mikroskopischer Ebene zu dendroökologischen Forschung angewendet. Darüber hinaus ist die genaue Timing dieser Wachstumsreaktionen in natürlich gewachsenen Bäumen, die für genaue Datierung Zwecke selten vor kurzem 15 dokumentiert.

In Bezug auf die Auswirkungen der globalen Erwärmung 16, um die Verbesserung bestehender und Entwicklung neuer Techniken zu erfassen und zu quantifizieren, vergangene und laufende Umweltprozesse erforderlich ist, insbesondere im Hinblick auf die Klimafolgenforschung 11.Mit dem Ausbau der traditionellen Holz anatomische Forschung zu einer ökologisch basierte Holzanatomie 17 kann Dendro-Wissenschaftler neue Parameter zu analysieren und entwickeln neue Methoden, um die kurz- und langfristigen Auswirkungen von bestimmten Umweltfaktoren auf die Anatomie der Gehölze 18 zu verstehen. Detaillierte Kenntnisse über Veränderungen in verschiedenen Zellparameter in den einzelnen Ringen um spezifische Treiber (zB mechanische Kräfte, Klimaschwankungen) verwandt ist die Grundvoraussetzung für das Verständnis der Variabilität der Jahrringbildung. Im Vergleich zu herkömmlichen Ringbreitenmessungen, Identifizieren Holz anatomischen Variationen erfordert komplexere und expansive Präparationstechniken, die viel Arbeit und Zeit erfordern. Detaillierte Verfahren der Proben Schneiden, Färben und Einbettung sind vielfältig und sind immer abhängig vom Ziel der Studie 19.

Für makroskopische Analyse der Ringbreite in Nadelbäumen oder auch Strukturen für die Anzahl, Größe oder distribution von Schiffen in Harthölzern ist die Oberfläche einer Probe häufig mit feinem Schleifpapier oder Spezialschleifmaschinen 20 poliert. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist die Befüllung der einzelnen Zellen, die mit Staub, der ferner halbautomatischen mikroskopische Analyse 21 verhindert. Die besten Ergebnisse für makroskopischen Probenvorbereitung werden erzielt, wenn Probenoberfläche mit einer Rasierklinge oder einem anderen scharfen Messer.

Während für kleine Proben sind Rasierklingen ein perfektes Werkzeug; Proben größer als Kerne erfordern das Schneiden von ebenen Flächen über die gesamte Ausdehnung der Kerne. Im Gegensatz zu schleifen, sind die Zellen nicht mit Staub, was weitere Vorbereitung für die nachfolgende Bildanalyse ermöglicht gefüllt. Ferner sind die offenen Zellen Lumen die richtig geschnitten Zellwände und die ebene Fläche der gesamten Probe ermöglichen die Anwendung von Hochfrequenz-Densitometrie 22 auf den gesamten Umfang des Kerns. Für die Bildanalyse, die Oberfläche der Proben (ZellWände) können mit dunkler Tinte gefärbt werden, und die offenen Zellen Lumen kann anschließend mit weißer Kreide gefüllt, um den Kontrast zwischen der Zellwand und der Lumenfläche 19,23 zu verbessern. Diese recht einfache Technik ermöglicht eine Grund makroskopische Beurteilung der größeren Zellstrukturen für Schiffsgrößenmessungen.

Diese Verfahren zum Schneiden von Planflächen sind ausreichend für makroskopische Analysen. Für eine detaillierte holzanatomische (dh mikroskopische Analyse) wird die Durchlichtmikroskopie in Dendro Sciences angewendet am häufigsten verwendete Methode. Xylem Zellen differenzieren durch komplexe Prozesse umfassenden Zelltyp-Bestimmung, Zellteilung, Zelldifferenzierung und der programmierte Zelltod 24. Da der Zeitpunkt und die Geschwindigkeit, mit der diese Prozesse bestimmen Zell anatomischen Gegebenheiten können Umweltbedingungen beeinflussen diese Prozesse anatomische Abweichungen in der Ringstruktur zu erzeugen. Als wichtige Voraussetzung für diese Analyses, müssen Mikroschnitte mit einem Mikrotom 19 hergestellt werden. Bei der Herstellung von Proben für das Schneiden, ist die Sichtbarkeit der Tracheid oder Faserrichtung entscheidend. Die Verwendung von Hand angetrieben Schlittenmikrotome wird empfohlen, Mikro Abschnitte geschnitten, weil diese Technik erleichtert hochwertige Abschnitte wie für Bildanalysen erforderlich 19. Abhängig von der spezifischen Ziel einer bestimmten Studie werden Mikroschnitte senkrecht oder parallel zur Längserstreckung der Zellen geschnitten. Diese Abschnitte werden dann unter dem Mikroskop fotografiert und Zelldimensionen gemessen mit speziellen Bildanalyse-Software.

Bis vor kurzem war die Fähigkeit, Mikro Abschnitten herzustellen, um kleine Probenmengen nur (ungefähr 1 cm x 1 cm) beschränkt. Dies ist akzeptabel, Einzelereignisse wie Störungen in bestimmten Jahren zu analysieren, aber diese Technik nicht die erweiterte Zeitreihenanalyse für Umweltrekonstruktionen notwendig zu erlauben. Dieser Aufwand kann nur zu realisierendurch die Entwicklung von neuen, effizienten und wirtschaftlichen Herstellungsverfahren und Analyseverfahren d. In den letzten Jahren haben die Mitglieder des Jahrringlabor an der Eidgenössischen Forschungsanstalt WSL in der Schweiz intensiv an diesem Thema gestartet. Als Ergebnis neuer Geräte und Analysetechniken entwickelt worden, um die Idee der Integration Holz anatomische Merkmale auf einen breiten Bereich von Umweltforschungsthemen unterstützen.

Protocol

1. Stichprobenverfahren Kernproben Für die Probenahme Baumstämme, extrahieren mindestens zwei Kerne mit einer Schrittweite Greifer aus jedem Stamm der Wachstumsentwicklung analysieren. Variieren Sie die Position der Probennahme auf der Forschungsaufgabe, zB für gemeinsame Klimarekonstruktionen nehmen Sie die Kerne parallel zum Hang. Bei der Arbeit mit Arten, nehmen Sie mindestens drei oder mehr Kerne. Verwenden Sie eine scharfe Zunahme Greifer (5, 10 oder 12 mm Durchmesser) und setzen Sie den Kernbohrer senkrecht zur Wachstumsachse des Schafts. HINWEIS: Um eine kontrollierte und stabile Lage des corer haben, verwenden Sie einen Schieber, um Bewegungen des andere als seine Drehgreifer zu vermeiden, wenn das Bohren sie in den Baum. Bohrung in den Schaft ganz in und durch das Mark. Zum Kern sehr dichten Wald (dh tropische Arten), werden spezielle rekonfiguriert Kettensäge Körper mit einem Adapter der Bohrkerne, die Kern auch dichten Wäldern wie Diospyrus ebenum ermöglichen (Ebenholz). </ Li> Verwenden Sie einen Abzugs und entfernen Sie den resultierenden Kern vom Baum. Schalten Sie das corer und entfernen Sie sie aus dem Stamm. Hinzufügen einer spezifischen ID zu der extrahierten Kern mit einem weichen Bleistift durch Schreiben auf ein Band, das dann direkt auf dem Kern platziert. Wiederholen der Prozedur auf der gegenüberliegenden Seite des Stiels. Bewahren Sie die zwei Proben des Baumes in Kunststoff oder Papier Rohre oder spezielle Boxen, um Schäden zu verhindern. HINWEIS: Papierstrohe sind von Vorteil vor allem in tropischen Umgebungen, weil sie verhindern, dass die Kerne aus Form. Abschließend hängen Sie die Kerne (Faserrichtung senkrecht) auf Holzstützbalken. Verwenden Sie kaltes Wasser resistent Holzleim und trocknen lassen. HINWEIS: montieren Sie niemals die Kerne auf Holzunterlagen, wenn das Ziel der Studie umfasst weitere chemische, Isotop oder Dichteanalyse. Zu diesem Zweck legen die Kerne in offenen Kabelkanälen oder einem einzigen Wellpappe. Mikrokernproben Verwenden Sie eine spezielle Stanzvorrichtungoder Nadel mit einer Öffnung von 2 mm. In Abhängigkeit von der Rindendicke mit einem Meißel, um einen notwendigen Teil der Rinde zu entfernen. Platzieren der Vorrichtung senkrecht zu der Wachstumsachse auf dem Stamm, wie oben beschrieben, und mit einem Hammer das Xylem des Schafts bis etwa 2 cm in die Tiefe eindringen. Drehen Sie die Nadel, um den resultierenden Mikrokern im Werkzeug zu brechen und entfernen Sie sie aus dem Stamm. Bewahren Sie die Mikrokerne in Mikrofläschchen und beschriften. Disc Probenahme In besonderen Fällen (und vor allem in den Tropen), beispielsweise bei der Probenahme Stümpfe und umgestürzte Bäume oder soweit möglich, Scheiben (Querschnitte senkrecht zur Wachstumsachse) mit einer Kettensäge. Einfach Beschriften Sie die Discs und lagern Sie sie bis zur weiteren Analyse. HINWEIS: Dieses Probenahmeverfahren wird in der Regel für alle Trocken tot, historische, archäologische und Unter fossiles Material sowie sehr dichte Laubhölzer, die den Einsatz Zuwachsbohrer nicht zulassen angewendet. </ol> 2. Probenvorbereitung Schleifscheiben Legen Sie die Scheiben auf einer Schleifmaschine und schleifen Sie die Oberfläche mit einer Folge von immer feineren Schleifmittel, mit Schleifpapier der Körnung 80, gefolgt von 120, 220, 300 Körnung. Eine abschließende Polieren mit 400er reicht für die meisten Nadelbäume. Für Harthölzer und vor allem Arten, Nutzung Schleifkörnungen bis 1200, um die wachstumsZonenGrenzen zu unterscheiden. Schneidplanflächen auf Kerne Fixieren die Bohrkerne in dem Kernhalter eines neu entwickelten Kern Mikrotom ermöglicht, ebenen Flächen an Kernen über ihre gesamte Ausdehnung geschnitten. HINWEIS: Korrigieren der Ausrichtung des Kerns innerhalb des Halters, um die Faserrichtung der Probe aufrecht, die in einem rechten Winkel auf das Messer des Mikrotoms ist zu haben. Heben Sie den Kern, bis es die Klinge leicht berührt. Ziehen der Klinge, die auf Kugellager-Führung über die Ausdehnung des Kerns befestigt ist, die an die CUt off einen ersten Teil der Oberseite. Schieben Sie das Messer hinter dem Kern, heben Sie den Probenhalter mit dem Kern etwa 10 um und wiederholen Sie den Schneidvorgang. Tun, bis etwa ein Drittel des Durchmessers des Kerns nach unten, was zu einer kontinuierlichen ebenen Oberfläche geschnitten. Vorbereitung Mikroschnitte durch Hinzufügen Maisstärkelösung. Für detaillierte Bildanalyse der anatomischen Struktur, fix Kernen oder anderen Proben Abspaltung von Scheiben in die Halterung eines Mikrotoms. Positionieren Sie den Mikrotomklinge, durch eine Kugellagerführung eines neu entwickelten Schlittenmikrotoms an der oberen Kante der Probe geführt und ziehen Sie darüber. Schieben Sie die Klinge zum Anheben der Probe von etwa 20 bis 30 um und ziehen Sie die Klinge über die Probe wieder. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis eine durchgehende Fläche auf der Probe erzeugt wird. Decken die resultierende Oberfläche mit einem Maisstärkelösung (10 g Maisstärke, 8 ml Wasser und 7 g 100% glycerol) mit einem gemeinsamen Bürste. HINWEIS: Die Stärkekörner füllen die offenen Zellen der Probe für die anschließende Schneiden der dünnen Abschnitten die Struktur zu stabilisieren. Heben Sie die Probe mit 15 & mgr; m, legen Sie eine Bürste auf der Oberfläche der Probe und ziehen Sie die Klinge langsam in Richtung der Probe beginnen, schnitt ein dünner Abschnitt (unterhalb der Bürste). Beim Schneiden, gleitet der resultierende Abschnitt auf der Klinge durch den Pinsel geführt. Wenn der gesamte Abschnitt geschnitten wird, entfernen Sie den Mikrobereich von der Klinge mit einer Bürste und Wasser (zur Verringerung der Reibung) und setzen Sie den Abschnitt auf einen Objektträger zur weiteren Vorbereitung. Um sie vor dem Austrocknen zu verhindern, decken sie unter Verwendung einer kleinen Menge Glycerin (33% = ein Teil der 100% Glycerin und zwei Teile Wasser). 3. Mikroobjekt Vorbereitung Für die nach der Herstellung von Dauerrutschen, zuerst die Glycerin waschen vom Mikrobereich mit einer Pipette und Wasser. Bedecken Sie den nassen seRésol mit einigen Tropfen Safranin (1 g Safranin Pulver + 100 ml Wasser) und Astrablue (0,5 g Astra blaues Pulver + 2 ml 100% Essigsäure + 100 ml Wasser), um zwischen verholzten und nicht verholzten unterscheiden Strukturen, sondern auch, um den Kontrast für die nachfolgende Bildanalyse zu verbessern. Lassen Sie den Abschnitt Rest für 5 Minuten durch den Farbstoff überzogen und dann waschen Sie sich mit einer Pipette und nochmals Wasser. Sobald die überschüssige Farbstoff entfernt wird, trocknen die Sektion mit Pipetten durch Waschen mit einer Sequenz von 75% verdünnt, 96% und schließlich 100% Ethanol. Pipetten, die Proben auf dem Objektträger statt, indem die Proben in einem Bad, die Verarbeitungszeit auf etwa zwei bis 3 min für das gesamte Entwässerungsprozess zu reduzieren spülen. HINWEIS: Die Dehydratisierung mit Ethanol verhindert fragile Proben aus brechen. Danach spülen Sie den Abschnitt mit 100% Xylol. HINWEIS: Xylol ist krebserregend und Lüftung ist im Labor obligatorisch, wenn Sie es. AndereProdukte bestehen ersetzen Xylol, aber wenn es Absicht, die Proben über einen längeren Zeitraum (Jahre, Jahrzehnte) für eine mögliche erneute Analyse zu speichern, ist Kanadabalsam (Schritt 3.5.2) der einzige Einbettmedium, die klar, ohne Farbe im Laufe der Zeit bleibt. Leider Kanadabalsam muss in Kombination mit Xylol verwendet werden. Solange das Xylol milchig (weißlich) Wiederholen Dehydratationsverfahren, da es nicht ausreichend dehydriert. Sobald das Xylol klar bleibt, decken Sie den Abschnitt mit einem Rückgang von 100% Kanadabalsam und bedecken Sie es mit einem Deckglas von mindestens der Größe des Abschnitts. HINWEIS: Achten Sie auf Entfernen von Luftblasen durch leichtes Eindrücken der Glasabdeckung nach unten. Legen Sie die resultierenden Mikroschlitten zwischen zwei Streifen aus hitzebeständigem Kunststoff und legen Sie sie auf eine Metallplatte. Legen Sie ein Gewicht (zB ein Magnet) am oberen Rand der Folie, um sie nach unten drücken, um den Abschnitt in der folgenden Trocknungsprozess flach zu halten. Objektträger in einem Ofen bei60 ° C für etwa 12 Std. Nach 12 Stunden, nehmen Sie die Folien aus dem Ofen heraus und legen Sie sie auf einem Regal sie abkühlen auf Raumtemperatur (ca. 20 ° C) zu lassen. Abkühlen lassen, entfernen Sie das Gewicht und den Kunststoffstreifen und reinigen Sie die Folie mit Rasierklingen, den Überschuss Kanadabalsam zu entfernen. 4. Die Visualisierung von Zellinhalten Bereiten Nawashin Lösung 25. Es wird eine Lösung (A) mit 5 g Chromsäure, 50 ml 96% iger Essigsäure und 320 ml entionisiertes Wasser. Bereiten andere Lösung (B) mit 200 ml von Formalin mit 175 ml entionisiertem Wasser. Mischungs Lösung A und Lösung B in einem 1: 1-Verhältnis, das Nawashin Lösung. Um den Inhalt der Zelle zu visualisieren, fixieren Sie die Probe mit Nawashin Lösung für 10 Minuten, um alle Abbauprozesse in der Zelle zu stoppen. HINWEIS: Die Fixierung bewahrt Zellkernen ermöglicht für die Einschätzung der Zelle Langlebigkeit (Langlebigkeit der Zelle = vorhandenen Kerne / Kerne fehlt; die Anwesenheit or Abwesenheit des Kerns zeigt an, ob die Zelle lebend oder tot). Nach der Fixierung, waschen Sie die Teile mit Wasser, um die Nawashin Lösung vollständig zu entfernen, bevor sie mit der Färbung mit Safranin-Astra Blau und zusätzlich vor der Anfärbung mit Pikrinsäure-Anilinblau (1 Teil gesättigte wasserlösliche Anilin blau + 4 Teilen 10% Pikrinsäure) . Erhitze der Probe auf etwa 80 ° C (in jedem Fall unter dem Siedepunkt), um den Färbevorgang zu beschleunigen. Zur Entwässerung und Einbettung der Proben folgen das Protokoll die Schritte 3,4-3,8. 5. Vorbereitung Digitale Bilder des anatomischen Merkmale Erstellen Sie digitale Bilder von Kernflächen zur Gefäßanalyse. Schneiden Sie die Kernoberflächenebene mit Hilfe der Kern Mikrotom und Flecken auf der resultierenden Oberfläche schwarz indem Sie einfach mit einem Filzschreiber. Sobald der Farbstoff wird getrocknet, reiben die Oberfläche des Kerns mit weißer Kreide. Drücken Sie die Kreide in den Zellen durch einfaches Reiben der Kreide über dieOberfläche mit dem Finger. Entfernen Sie auch den Überschuß durch dieses Verfahren Kreide. HINWEIS: Dadurch werden die Zellwände sind schwarz und die Lumenteile der Gefäße sind weiß. Dieser Kontrast ist die Voraussetzung für eine automatisierte Bildanalyse. Die vorbereitete Kern unter einem Binokular mit einer Digitalkamera ausgestattet. Nimm eine Sequenz von leicht überlappenden (ca. 10%) Bilder beginnend an einer Seite des Kerns, bis die gesamte Oberfläche eingefangen wird. Nähen Sie die Einzelbilder zu einem Gesamtbild der Kernoberfläche erstellen. Erstellen Sie digitale Bilder von Objektträger Legen Sie die gereinigten Objektträger unter dem Mikroskop und nehmen Sie einander überlappende Aufnahmen aus dem gesamten Abschnitt. Definieren Sie eine bestimmte Vergrößerung abhängig von den Strukturen zu analysieren, die zwischen 40X und 1,000x Vergrößerung. Nähen Sie die Einzelbilder zu einem Gesamtbild der Abschnitt erstellen. Zur Vermeidung von Verzerrungen bei der Heftvorgang zu vermeiden, verwenden Sie ", Planen "-Typ Objektive mit dem Mikroskop. 6. Quantifizierung anatomischer Merkmale Um Zellen und Ring Grenzen mit Hilfe der Bildanalyse-Tool ROXAS18 oder ähnliche Software erkennen, laden Sie ein vollständiges Bild eines Mikrobereich und der damit verbundenen räumlichen Kalibrierung auf quantitative Ergebnisse in metrischen Einheiten zu erhalten. Berechnen der räumlichen Kalibrierung durch Messen der Anzahl der Pixel zwischen den Skalen der Mikrometerstufe Bilder gleichzeitig Vergrößerung und Dividieren des erhaltenen Wertes durch den Schuppenabstand in metrischen Einheiten (zum Beispiel 1,000 um). Wählen Sie aus der angezeigten Liste (in der Software zur Verfügung gestellt) eine geeignete Konfiguration vor dem Start des automatischen Teil der Analyse. ANMERKUNG: Eine Konfiguration ist eine zuvor optimierten Satz von Programmeinstellungen, die zum Beispiel berücksichtigt die Streichfarbe von der Probe und der Größe und Form Bereich der Zellen nachgewiesen werden. Maßgeschneiderte Konfigurationen damitermöglichen eine optimale Erkennungsergebnisse für die verschiedenen Arten und Bildqualitäten zu produzieren. Wählen Sie weitere Optionen wie den Einsatz von Regionen in dem Bild, die ein- oder ausgeschlossen werden, um zu vermeiden, sind zB leere Bildränder oder Risse in der Probe, falls erforderlich. Starten Sie die Analyse, indem Sie die Schaltfläche Analysieren. Wird entschieden, definieren Bereiche in dem Bild, die ein- oder ausgeschlossen mit dem Polygon, Rechteck oder Kreis-Werkzeug werden. Die folgende automatische Analyse verwendet flexible Algorithmen einige Bild Mängel (zB schlechten Kontrast) auf der Grundlage der Qualität des Bildes zu korrigieren und zu verbessern den Kontrast.

Representative Results

Alle dendroökologischen Analysen hängen von genauen Proben, egal ob Scheiben, Kernen oder Mikrokerne werden übernommen. Dazu müssen die Geräte in perfekter Form (genauer geschärft) sein, um Mikrorisse in der Holzprobe zu vermeiden. Bei der Herstellung von Oberflächen an Bohrkernen, ist die Verwendung eines Kerns Mikrotom wesentlich. Die Fähigkeit zur offenen Zellen, die weiter behandelt werden, um den Kontrast zu erhöhen für Bildanalysen und Schiffsgröße Messungen (Abbildung 1) werden müssen, ist ein erster wichtiger Schritt zur Anpassung der anatomischen Strukturen in Zeitreihenanalysen. Manchmal ist die Dichte eines Hartholzprobe verhindert die Verwendung eines Mikrotoms. In diesem Fall eine richtige Politur und anschließender Entfernung des übermäßigen Sägemehl aus den Gefäßen mit einem Kompressor oder Vakuum ist die beste Option. Für weitere detaillierte Analysen der kleineren Zellstrukturen wie Früh- und Spätholz Tracheiden in Nadelbäumen, sind qualitativ hochwertige Mikroschnitte benötigt. Hier potential Artefakte wie sekundäre Zellwände von der primären Wand Notwendigkeit zu vermeiden (Figur 2) abgezogen. Wenn diese Artefakte in den digitalen Bildern auftreten, ist eine automatisierte Analyse der Zellabmessungen nicht mehr möglich. Die Artefakte müssen dann manuell korrigiert werden, was zeitaufwendig und in den meisten Fällen zu einer fehlerhaften Messung der Zellabmessungen ist. Das einfache Anlegen eines Nicht-Newtonschen Fluids, dh einem Maisstärkelösung, um die Oberseite der Probe unterstützt die Stabilität der Struktur und reduziert das Auftreten von Artefakten auf einem Minimum (Figur 2) 26. Diese Anwendung von Maisstärke, geeignet für alle Holzproben einschließlich Arten, macht die Anwendung des Einbettungsverfahren zu den Proben vor dem Schneiden redundant. Micro Abschnitte ermöglichen eine sichere Bestimmung der Jahresringe. Dies ist insbesondere der Fall bei Nadelbäumen auf ihre natürlichen Grenzen, dh wachsenden </ Em>, an der Waldgrenze in hochalpinen Gebieten. Extrem schmale Ringe sind häufig und schwer zu makroskopisch erkennen (Abbildung 3). In extremen Fällen können die Ringe bestehen aus einer oder zwei Reihen von Frühholzzellen und eine Reihe von abgeflachten Spätholz-Zellen, die (im Gegensatz zu gemeinsamen Spätholzzellen) verdickt Zellwände fehlen. Dafür sind sie besser oder auch nur sichtbar, wenn unter Verwendung von Mikroschnitten. Darüber hinaus können Dichteschwankungen von Zonengrenzen deutlicher unterschieden werden, die den Nachweis der Jahresringe vor allem im Mittelmeerraum und den Tropen (Abbildung 3) vereinfacht. Bei der Analyse von Bildern bei einer Vergrößerung von 40X oder mehr, sind einzelne Zellen sichtbar, und die Dicke der Zellwand ist ebenfalls nachweisbar. Halbautomatische Analyse-Software ermöglicht die Messung bestimmter Parameter entlang definierten Pfade nach der Richtung ihrer zeitlichen und räumlichen Entwicklung (Abbildung 4). Damit changes einzelner Parameter wie beispielsweise die Zelle Lumen oder Zellwandstärke über den gesamten Umfang eines Jahresring (Abbildung 4) bestimmt werden. Dies kann für alle Ringe im Bild sichtbar gemacht werden, und dies unterstützt vollständig die Notwendigkeit für eine ausgedehnte Zeitreihenanalyse. Bildanalysen können auch verwendet werden, um die Entwicklungsphasen der Jahresringe innerhalb der Vegetationsperiode (Abbildung 5) zu bestimmen. Bei der Analyse der Aufnahme eines Ausschnitts mit Safranin und Astra-blau mit polarisiertem Licht, auch die verschiedenen Stufen der Verholzung, beginnend in den äußersten Ecken der Zellenwände bis zur vollständigen Verholzung der sekundären Zellwand befleckt, werden sichtbar. Denn die verholzten (reifen) Zellwände leuchten in polarisiertem Licht (Abbildung 5). Detaillierte Informationen finden Sie auf Umweltdaten für den jeweiligen Vegetationsperiode dokumentiert bezogen werden, um zum Beispiel eine genauere Klima-Wachstums relati bestimmen terschaft. Abbildung 1. Beispiele für einen Mikroschnitt und eine vorbereitete ebene Fläche eines Eichen einschließlich Ringbreite und Schiffsgröße Messungen. Links: äußerste Teil einer Eiche Bohrkern. Die 5 mm Kerndurchmesser wurde mit einem Kern Mikrotom geschnitten. Die Oberfläche wurde dann mit einem Filzstift schwarz gebeizt und die Zellen wurden mit weißer Kreide gefüllt, nachdem der Fleck trocken war. Rechts: das Diagramm angibt Ringbreite und Gefäßgröße Messungen an der Oberfläche des auf der linken Seite gezeigten Kerns erfolgt. Keine Mikroschnitte waren nötig, um diese Messungen zu tun durch die klare Oberfläche, die durch die Kern Mikrotom (nach 21 modifiziert). Unten: Micro Abschnitt aus einem Bohrkern geschnitten, gefärbt, dehydriert und in Kanadabalsam fixiert. Dicke: 20 & mgr; m, Länge: 25 cm. g "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. Abbildung 2. Bilder von Mikro Abschnitte geschnitten ohne Stabilisierung gegenüber einem Abschnitt geschnitten mit dem Maisstärkelösung. Links: Micro Schnitt, Schneiden Artefakte in den Frühholz Tracheiden eines Nadelbaums. Die Probe wurde ohne Einbettung geschnitten und als Ergebnis die eher dünn Sekundärwände der Frühholzzellen wurden von der Hauptwand (blaue Pfeile) aufgeteilt. Rechts: Mikrobereich ohne Artefakte in den Frühholz Tracheiden eines Nadelbaums. Dieser Abschnitt (gleiche Probe wie links abgebildet) wurde nach dem Auftragen der Maisstärkelösung mit einer Bürste auf der Probenoberfläche zu schneiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. ove_content "fo: keep-together.within-page =" always "> . Abbildung 3. Beispiele für kaum nachweisbar Jahrringgrenzen Links: Micro Abschnitt eines Bohrkerns (hier: Larix decidua) zeigt einen Ring Grenze (schwarzer Pfeil) durch eine einzige Reihe von abgeflachter Spätholzzellen ohne Verdickung der Zellwand angezeigt. Dieser Ring nicht makroskopisch sichtbar. Rechts: Intra-Jahresdichteschwankungen (weißer Pfeil) sind häufig in mediterranen Arten (Mikrobereich: Quercus ilex). Die allmähliche Veränderung der Zellstruktur in Richtung Spätholz und zurück zum Frühholz Struktur (weißer Pfeil) ermöglicht die Differenzierung Dichteschwankungen von echten Zonengrenzen (schwarzer Pfeil). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. <p class="jove_content" fo:keep-together.witHin-page = "always"> Abbildung 4. Abbildung der Lumenfläche und Wanddickenmessung im Rahmen eines jährlichen Ring von einem Nadelbaum. Oben: Ausschnitt-Bild, das eine exemplarische Ergebnisse der ROXAS Analyse in einem Baum-Ring von Pinus sylvestris (Waldkiefer). Ring Grenzen werden gelb angezeigt und Umrisse von Tracheid Lumina in Cyan. Für eine radiale Datei (blau Tracheid Lumina) die gemessenen Zellwandstärken wird durch rote Kreise dargestellt. Schwarze Balken = 100 um. Unten:. Die inner jährlichen Veränderungen Tracheid Lumenfläche und Tracheid Zellwandstärke für den gesamten Jahresring Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. Abbildung 5. example eines Formjahresring. Das Bild wurde unter einem Lichtmikroskop mit polarisiertem Licht von einer aus einem Mikrokern auf Juli von einem Larix decidua abgetastet 7. 2007 wachsen in die erhaltene Safranin und Astra-blau gefärbte Mikrobereich eingefangen Lötschental auf 1.300 m über dem Meeresspiegel. Auf dieser Mikroschnitt die cambial Zellen, die Zellen in den Erweiterungsphase werden die Zellen in der Wandverdickungsphase und die reifen Zellen sind erkennbar. Die tangentiale Breite des Bildes abdeckt ~ 1 mm von Xylem Querschnitt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Discussion

Die Herausforderungen für eine erfolgreiche und nachhaltige Integration der Holzanatomie in dendroökologischen Forschung sind neben vielfältigen analytischen Problemen, vor allem auf technische Aspekte. Diese Herausforderungen reichen von Prinzip Stichprobenverfahren zur Erstellung von qualitativ hochwertigen Mikroschnitte und ihre anschließende Analyse 19.

Auf den ersten Blick ist die Entnahme von Kernen oder auch Scheiben ein einfaches Verfahren, das seit vielen Jahren bekannt ist. Es gibt viele Dinge, die schief getan werden kann, und eine kleine Ungenauigkeit bei der Probenahme kann zu schweren Problemen bei der weiteren Ausarbeitung und Analysephase zur Folge haben. Kleine Ungenauigkeiten wie Kernbohrungen, die nicht exakt senkrecht zur Schaftachse oder mit einem unvollkommen geschärft Greifer sind kein Problem, wenn das Ziel der Studie beschränkt sich auf die Messungen Breiten klingeln. Wenn jedoch mit dem Ziel für die mikroskopische Analyse der Proben, eine falsche Richtung Probenahme könnte in optischen Verzerrungen führenZellwände, während der Verwendung von stumpfen Entkernern Ergebnisse in Mikrorisse innerhalb des Kerns. Als Ergebnis, wenn Sie versuchen, um Mikroschnitte dieser Adern schneiden die dünnen Abschnitte nur auseinanderfallen und eine effiziente Vorbereitung nicht mehr gewährleistet. Dasselbe gilt auch für die Mikro-Kernproben. Eine stumpfe Spitze wird in Hochdruck führen, wenn der Kämpfer in das Stammholz eingeschlagen. Folglich ist die kambiale Schicht komprimiert. Die cambial Zellen (Figur 5) werden folglich zusammengedrückt und kann nicht analysiert werden.

Disc Probenahme ist in der Tat die beste Strategie bei der Analyse von Wachstumsschwankungen, um sie auf Veränderungen der Umwelt beziehen. Leider ist es einfach unmöglich, Scheiben von allen Bäumen soll für weitere Analysen beprobt werden zu nehmen. Dennoch, insbesondere im Falle der tropischen dendrochronology, eine bestimmte Menge der Stammscheiben in Kombination mit Bohrkerne benötigt. Die Festplatten werden als Basis für die Zonengrenzen zu definieren und verwendet dafür die boundar unterstützenn definiert, basierend auf der Analyse Bohrkerne 12,27,28.

Die Vor- und Nachteile von Schleif gegen Schneid werden häufig diskutiert 1,11,21. Wie oben erwähnt, die beste Vorgehensweise ist immer abhängig von der Forschungsfrage und die Parameter zu analysieren (makroskopische oder mikroskopische) werden. Von größter Bedeutung, wenn Isotopen oder chemische Analysen werden in einem weiteren Arbeitsschritt projiziert wird, ist es, dass der Schleifstaub erzeugt durch Schleifen, dass kann in Zell Lumen über die gesamte Probe zu füllen, wird sorgfältig durch Absaugen oder Druckluft entfernt.

Schneiden Mikroschnitte ist für alle mikroskopisch analysiert die am besten geeignete Weg zur Herstellung von Proben für weitere Analysen. Zunächst wird der Abschnitt von der Probe, die dann ohne jegliche Kontamination für mögliche weitere Analysen aufbewahrt werden abgeschnitten. Zweitens diese Abschnitte ermöglichen hochauflösende Messungen der Einzelzellparameter. Außerdem vermeidet die zeitaufwendige EinbettungVerfahren unter Verwendung einer Maisstärke Lösung 26, um die Zellen zu stabilisieren ist ein großer Vorteil in der Mikroschneide.

Ein Nachteil der Mikroschneide ist immer noch der begrenzten Stichprobengröße, was zu langen Vorbereitungszeiten. Für die Echtzeitreihen-Analysen zurückgehen in der Zeit über Jahrhunderte oder sogar Jahrtausenden gibt es eine Notwendigkeit, bestehende Schneidvorrichtungen 17,19, aber auch Bildverarbeitung und -analyse 18 weiter zu entwickeln. Ein erster Schritt in diese Richtung ist die Entwicklung von Kern Mikrotom 21, zunächst auf ebenen Oberflächen auf Kerne (1) geschnitten wird. Jüngste Tests zeigte die Fähigkeit, Mikroschnitte ganzer Kerne mit diesem Gerät (Abbildung 1) zu schneiden.

Hochwertige Mikro Abschnitten finden Sie das Grundprinzip für eine effektive Bildanalyse. Unter die Bilder unter dem Mikroskop ist ein übliches Verfahren 19, aber ihre effektive Analyse ist nach wie vor eine Aufgabe, die Bedürfnisseweiterentwickelt 17 werden. Alle vorhandenen Bildanalysesysteme sind halbautomatisch, das heißt sie müssen mehr oder weniger stark durch den Techniker gesteuert. In vielen Fällen müssen die Bilder korrigiert werden oder sogar neue Bilder müssen durchgeführt, um den Kontrast für eine bessere Erfassung der Strukturen von der Software ohne Änderung Zellwanddicke innerhalb des Bildes zu verbessern.

Spezialisierte Bildanalysewerkzeuge wie ROXAS 18, WinCell oder spezifische Skripte für ImageJ 29 in der Lage, grundlegende anatomische Daten wie Zellzahl, Zelldimension, Zellwandstärke und Zellenposition im Rahmen des jährlichen Ring geben. Viele zusätzliche anatomischen Metriken, die in einem dendroökologischen Kontext relevant sind, können von diesen grundlegenden Messungen wie Größe der größten Leitungen, Größenverteilung von Leitungen, die Größe der Früh- oder der ersten Reihe von Leitungen (optische) Holzdichte, intra-Jahres berechnet werden Profile der Leitungsgröße und ZellwandDicke, und Gruppierungsmuster der Leitungen (einsame, Multiples, etc.).

Mit der Software ROXAS 18 werden die Umrisse der Leitungs Lumina (dh wasserleitenden Zellen) und Jahresringgrenzen automatisch erkannt und visuell als Overlays über das Originalbild dargestellt. Erkennungsalgorithmen für die Leitungen auf Farbe, Größe und Form Informationen, Erkennungsalgorithmen für Ring grenzt an den lokalen Kontext jeder Leitung basiert. Eine Toolbox ermöglicht es uns, diese Ergebnisse von Hand zu verbessern, indem das direkte Editieren der Overlay-Funktionen, dh, Löschen, Hinzufügen und Ändern von Grenzen und Ringleitung beschreibt. Nach dem Bearbeiten wird die endgültige Datenausgabe, einschließlich der Zellwanddicke (Koniferen), automatisch erzeugt und in einer Tabelle gespeichert. Vollautomatische Systeme sind derzeit nicht verfügbar, auch nicht für Nadelbäume, die eine relativ einfache Struktur, aber das ist ein Ziel, für zukünftige Entwicklungen. Dies würde starke Unterstützung für die full Integration von Holz anatomische Parameter in Zeitreihenanalysen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge the effort of Sandro Lucchinetti (Schenkung Dapples, Zürich) for constructing the devices needed to guarantee progress in sample preparation.

Materials

Increment corer http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article
&id=57&Itemid=88&lang=en
Core-Microtome http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN
Laboratory microtome http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN
Trephor micro corer http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp
Nawashin solution Ten parts 1% chromic acid, four parts 4% formaldehyde and one part acetic acid
Picric-Anilin blue One part saturated aniline blue and four parts Trinitrophenol dissolved in 95% ethanol
Safranin Empirical Formula (Hill Notation) C20H19ClN4 
Astra-blue Empirical Formula (Hill Notation) C47H52CuN14O6S3 
Ethanol Linear Formula CH3CH2OH 
Xylol (Xylene) Linear Formula C6H4(CH3)2 
Canada Balsam Embedding solution for microscopy
Roxas Software http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN
ImageJ Software http://imagej.nih.gov/ij/
WinCell http://imagej.nih.gov/ij/
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References

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Gärtner, H., Cherubini, P., Fonti, P., von Arx, G., Schneider, L., Nievergelt, D., Verstege, A., Bast, A., Schweingruber, F. H., Büntgen, U. A Technical Perspective in Modern Tree-ring Research – How to Overcome Dendroecological and Wood Anatomical Challenges. J. Vis. Exp. (97), e52337, doi:10.3791/52337 (2015).
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