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Environment

Un point de vue technique dans Modern Arbre torique de recherche - Comment surmonter dendroécologique et bois anatomiques défis

Published: March 05, 2015
doi:
10.3791/52337
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1Landscape Dynamics / Dendroecology,Swiss Federal Research Institute WSL

Summary

Here we present a protocol outlining how to sample wooden specimens for the overall assessment of their growth structures. Macro- and microscopic preparation and visualization techniques necessary to generate well-replicated and highly resolved wood anatomical and dendroecological dataset, are described are described.

Abstract

Recherche dendroécologique utilise les informations stockées dans les anneaux des arbres pour comprendre comment les arbres isolés et même des écosystèmes forestiers entiers ont répondu aux changements environnementaux et enfin reconstruire ces changements. Cela se fait par analyse des variations de croissance dans le temps et la corrélation de divers paramètres spécifiques à l'installation de (par exemple) des records de température. Intégrer bois paramètres anatomiques dans ces analyses renforcerait reconstructions, même jusqu'à la résolution intra-annuelle. Nous présentons donc un protocole sur la façon de goûter, préparer et analyser les échantillons pour les analyses macroscopiques bois communs, mais aussi pour les analyses microscopiques ultérieurs. En outre, nous présentons une solution potentielle pour l'analyse d'images numériques générées par petits et grands spécimens communs pour soutenir l'analyse des séries chronologiques. Le protocole présente les étapes de base actuellement car ils peuvent être utilisés. Au-delà de cela, il ya un besoin continu pour l'amélioration des techniques existantes, et le développement de nouveaux techniques, d'enregistrer et de quantifier les processus environnementaux passés et en cours. Bois recherches anatomiques traditionnelle doit être élargi pour inclure l'information écologique à ce domaine de recherche. Cela soutenir dendro-scientifiques qui ont l'intention d'analyser de nouveaux paramètres et de développer de nouvelles méthodes pour comprendre les effets à court terme et à long terme des facteurs environnementaux spécifiques sur l'anatomie des plantes ligneuses.

Introduction

Arbres, ainsi que des arbustes, des arbustes nains, et même des herbes, montrent les schémas de réponse multiples liés aux changements dans leur environnement. Ces modèles ont été soumis à la botanique et la physiologie des plantes depuis le milieu du 19 e siècle. À l'époque, la recherche sur les plantes ligneuses axée principalement sur ​​les arbres et une analyse descriptive de la structure et la variabilité des cernes annuels dans un contexte écologique 1. Lorsque Andrew Ellicott Douglass a inventé la technique cross-dating pour la recherche des cernes 2, ce contexte écologique a été plus ou moins supprimée par la nouvelle capacité de dater précisément conclusions bois en archéologie. Croix-dating pour la première fois permis la datation précise des cernes à l'année civile et est jusqu'à présent considérée comme l'épine dorsale de la recherche des cernes dans tous les domaines de son application 1.

En parallèle, depuis la fin du 19ème siècle, l'anatomie du bois a évolué en une discipline de recherche important rapportentd à de nombreux autres domaines des sciences naturelles et appliquées 3. Deux grands domaines sont établis: l'anatomie systématique de bois, ce qui est la base pour identifier le bois en archéologie 4, et l'anatomie du bois appliquée, liée à la technologie du bois, de la physiologie, de la pathologie et de l'écologie 3,5.

Dans la recherche des cernes, dendroécologie nos jours est défini comme un sujet qui englobe les études dendrochronologiques liés mettant l'accent sur les études environnementales telles que les processus géomorphologiques (de Dendrogéomorphologie), la température et reconstructions des précipitations (dendroclimatologie), les changements de niveau d'eau (dendrohydrology) ou même des fluctuations des glaciers ( dendroglaciology) 6. Comme cette définition l'indique, analyses des cernes sont devenus de plus en plus important dans le domaine de la datation et de reconstituer les processus environnementaux tels que (i) les conditions climatiques du passé en analysant les variations annuelles de densité 9 de bois anneau de largeur 7,8 ou des isotopes 10, ou (ii) til récurrence des intervalles de processus géomorphologiques 11. Ces études très détaillées sur les variations de l'anneau de largeur et leur contenu isotopique démontrent la nécessité d'analyser plus en détail les anneaux, ce est à dire, pour étudier la structure anatomique des anneaux. Cependant, des études détaillées de bois caractéristiques anatomiques dans les anneaux annuels liés aux changements environnementaux sont rares 12,13. Bien que ces caractéristiques microscopiques sont connus 14, ils ont rarement été appliquées à un niveau microscopique à la recherche dendroécologique. En outre, le calendrier précis de ces réactions de croissance dans les arbres cultivés naturellement, essentiels pour la datation des fins précises, a rarement été documentée récemment 15.

En ce qui concerne les effets du réchauffement de la planète 16, l'amélioration de l'existant et le développement de nouvelles techniques d'enregistrer et de quantifier passées et en cours processus environnementaux est nécessaire, notamment en termes de recherche sur l'impact climatique 11.En élargissant bois recherches anatomiques traditionnelle à une anatomie du bois à base écologiquement 17, dendro-scientifiques peuvent analyser de nouveaux paramètres et de développer de nouvelles méthodes pour comprendre les effets à court et à long terme des effets des facteurs environnementaux spécifiques sur l'anatomie des plantes ligneuses 18. Une connaissance détaillée des variations de différents paramètres cellulaires au sein des anneaux individuels liés à des pilotes spécifiques (par exemple, les forces mécaniques, variations climatiques) est l'exigence fondamentale pour la compréhension de la variabilité dans la formation des cernes. Par rapport aux mesures d'anneau largeur communs, identifier bois variations anatomiques nécessite des techniques de préparation plus complexes et plus vastes qui nécessitent beaucoup de travail et de temps. Les procédures détaillées de la coupe de l'échantillon, la coloration, et l'incorporation sont multiples et dépendent toujours de l'objectif de l'étude 19.

Pour l'analyse macroscopique de la largeur des cernes dans les conifères ou les structures même pour le nombre, la taille ou distribution des navires dans les feuillus, la surface d'un échantillon est généralement polie en utilisant du papier abrasif fin ou rectifieuses spéciales 20. Un inconvénient de cette procédure est le remplissage des cellules individuelles avec la poussière qui empêche la poursuite de l'analyse microscopique semi-automatique 21. Les meilleurs résultats pour la préparation des échantillons macroscopiques sont obtenus lorsque la surface de l'échantillon sont coupés à l'aide d'une lame de rasoir ou un autre couteau pointu.

Alors que pour de petits échantillons, des lames de rasoir sont un outil parfait; des échantillons plus grands que les noyaux nécessitent la découpe de surfaces planes sur toute l'étendue de noyaux. A la différence de ponçage, les cellules ne sont pas remplis avec de la poussière, ce qui permet en outre la préparation pour l'analyse successive de l'image. En outre, la lumière de cellules ouvertes, les parois des cellules correctement coupées et la surface plane de l'ensemble de l'échantillon permettent l'application de la haute fréquence 22 densitométrie à toute l'étendue du noyau. Pour l'analyse d'images, la surface des échantillons (cellulairemurs) peuvent être colorées en utilisant l'encre noire et la lumière à cellules ouvertes peuvent ensuite être remplis avec de la craie blanche afin d'améliorer le contraste entre la paroi cellulaire et la zone de lumière 19,23. Cette technique assez simple permet une évaluation macroscopique base des structures cellulaires plus importantes pour les mesures de la taille des navires.

Ces techniques de coupe des surfaces planes sont suffisantes pour des analyses macroscopiques. Pour anatomique détaillée de bois (c.-à-microscopique) analyse, microscopie optique transmis est la méthode la plus courante appliquée en sciences dendro. Les cellules de xylème différencient par des processus complexes englobant un type de cellule détermination, la division cellulaire, la différenciation cellulaire et la mort cellulaire programmée 24. Depuis le moment et la vitesse à laquelle ces processus se produisent déterminer les caractéristiques anatomiques de la cellule, les conditions environnementales qui affectent ces processus peuvent générer des écarts anatomiques dans la structure cyclique. Comme une condition préalable importante pour ces analysers, micro sections doivent être préparés avec un microtome 19. Lors de la préparation des échantillons pour le sectionnement, la visibilité de la direction ou des trachéides fibre est cruciale. L'utilisation de la main entraînée microtomes coulissant est recommandé de couper micro sections parce que cette technique facilite sections de haute qualité selon les besoins de l'analyse d'images 19. En fonction de l'objectif spécifique d'un certain étude, les micro sections sont coupées perpendiculairement ou parallèlement à l'étendue longitudinale des cellules. Ces sections sont ensuite photographiées ci-dessous un microscope et les dimensions des cellules mesurées en utilisant l'image spécialisée analyses logiciel.

Jusqu'à récemment, la possibilité de préparer micro sections a été limitée à de petites tailles d'échantillon seulement (environ 1 cm x 1 cm). Ce est acceptable d'analyser des événements uniques comme les perturbations dans les années spécifiques, mais cette technique ne permet pas l'analyse étendue de la série de temps nécessaire pour reconstitutions environnementales. Cet effort ne peut être réaliserD à travers le développement de nouveaux, efficaces et économiques procédures de préparation et les techniques analytiques. Au cours des dernières années, les membres du laboratoire cernes au WSL Institut fédéral de recherches en Suisse ont commencé un travail intensif sur ce sujet. En conséquence, de nouveaux appareils et techniques d'analyse ont été développés pour soutenir l'idée d'intégrer bois caractéristiques anatomiques à un large éventail de sujets de recherche environnementale.

Protocol

1. Techniques d'échantillonnage Carottage Pour découle arbre d'échantillonnage, extraire au moins deux noyaux en utilisant un carottier de l'incrément de chaque tige pour analyser son développement de la croissance. Varier la position de l'échantillonnage sur le travail de recherche, par exemple, pour les reconstructions climatiques communes prennent le noyaux parallèle à la pente. Lorsque vous travaillez avec des espèces tropicales, prendre au moins trois ou plusieurs noyaux. Utilisez un carottier incrément aiguisé (5, 10 ou 12 mm de diamètre) et placer le carottier perpendiculaire à l'axe de plus en plus de la tige. NOTE: Pour avoir une position contrôlée et stable du carottier, utiliser un poussoir pour éviter les mouvements de la carottier autre que sa rotation lors du perçage dans l'arbre. Percer dans la tige tout le chemin dans et à travers la moelle. Pour noyau bois très dense (ce est à dire, les espèces tropicales), utiliser des corps de tronçonneuse reconfiguré spéciales avec un adaptateur de carottes qui permettent de base même bois denses que Diospyrus ebenum (Ebony). </ Li> Utilisez un extracteur et retirez le noyau résultant de l'arbre. Démouler le carottier et le retirer de la tige. Ajouter un ID spécifique à la carotte prélevée à l'aide d'un crayon doux en écrivant sur une bande, qui est ensuite placé directement sur le noyau. Répéter la procédure sur le côté opposé de la tige. Conserver les deux échantillons de l'arbre dans des tubes en plastique ou en papier ou des boîtes spéciales pour éviter tout dommage. REMARQUE: pailles en papier sont bénéfiques en particulier dans les environnements tropicaux car ils empêchent les noyaux de moulage. Enfin, monter les noyaux (de direction de fibre verticaux) sur poutres en bois. Utilisez l'eau froide de la colle de bois résistant et les laisser sécher. REMARQUE: Ne jamais monter les noyaux sur des supports en bois, si l'objectif de l'étude comprend une analyse plus approfondie de densité chimique, isotopes ou. Pour ces motifs, fixer les noyaux dans des conduits de câbles ouverts ou un seul carton ondulé face. Micro-carottage Utilisez un dispositif de poinçonnage spécialeou de l'aiguille avec une ouverture de 2 mm. Selon l'épaisseur de l'écorce utiliser un burin pour enlever une partie nécessaire de l'écorce. Placez l'appareil perpendiculaire à l'axe de plus en plus sur la tige comme décrit ci-dessus, et d'utiliser un marteau pour pénétrer le xylème de la tige à environ 2 cm de profondeur. Tournez l'aiguille de briser le micro noyau résultant intérieur de l'outil et le retirer de la tige. Conserver les micro noyaux dans des flacons à centrifuger et de les étiqueter. échantillonnage du disque Dans des cas particuliers (et en particulier dans les tropiques), par exemple, lors de l'échantillonnage des souches et des arbres tombés ou chaque fois que possible, prendre des disques (sections perpendiculaires à l'axe de plus en plus) avec une scie à chaîne. Il suffit de marquer les disques et les stocker jusqu'à nouvel analyse. NOTE: Cette procédure d'échantillonnage est le plus souvent appliquée pour tout le matériel sec morts, historique, archéologique et sous-fossiles ainsi que les feuillus très denses qui ne permettent pas l'utilisation de carottiers d'incrémentation. </ol> Préparation de l'échantillon 2. Disques de ponçage Placer les disques sur une machine à poncer et rectifier la surface en utilisant une séquence des abrasifs de plus en plus fines, à partir de papier de verre de grain 80, suivi par 120, 220, 300 grains. Un polissage final avec 400-grain est suffisante pour la plupart des conifères. Pour les feuillus et en particulier les espèces tropicales, l'utilisation de ponçage grains jusqu'à 1200 pour distinguer les limites croissance anneau. Coupe des surfaces planes sur des noyaux Fixer les carottes dans le support de base d'un microtome de base nouvellement développé qui permet de réduire les surfaces planes des noyaux sur toute leur étendue. REMARQUE: corriger l'orientation de l'âme à l'intérieur de la porte pour que le sens des fibres de l'échantillon en position verticale, ce qui est à angle droit de la lame du microtome. Soulevez le noyau jusqu'à ce qu'il touche légèrement la lame. Tirez la lame, qui est fixé sur la boule d'orientation portant sur l'étendue de la base de cut off une première partie de la partie supérieure. Repoussez le couteau derrière la base, soulevez le porte-échantillon avec le noyau d'environ 10 um et répéter la procédure de coupe. Pour ce faire, jusqu'à environ un tiers du diamètre de la base est coupé résultant en une surface plane continue. Préparation de micro-sections par addition d'une solution d'amidon de maïs. Pour l'analyse d'image détaillée de la structure anatomique, fixent noyaux ou d'autres échantillons clivés à partir de disques dans le titulaire d'un microtome. Positionner la lame de microtome, guidé par un roulement à billes direction d'un microtome à traîneau nouvellement développé sur le bord supérieur de l'échantillon et tirer dessus. Repousser la lame de lever l'échantillon d'environ 20 à 30 um et de tirer la lame sur l'échantillon à nouveau. Répéter cette procédure jusqu'à ce que une surface continue sur le dessus de l'échantillon est créé. Couvrir la surface résultante avec une solution d'amidon de maïs (10 g d'amidon de maïs, 8 ml d'eau et 7 g de 100% glycérol) avec une brosse commun. REMARQUE: Les grains d'amidon se remplissent les cellules ouvertes de l'échantillon pour stabiliser la structure de la coupe ultérieure des coupes fines. Soulevez l'échantillon de 15 um, placer un pinceau sur la surface de l'échantillon et tirer la lame lentement vers l'échantillon de départ de couper une section mince (ci-dessous la brosse). Pendant la coupe, la section résultant glisse sur la lame guidé par la brosse. Lorsque la section entière est coupée, retirez la section micro de la lame avec une brosse et de l'eau (pour réduire la friction) et placez la section sur une lame de verre d'une préparation supplémentaire. Pour les empêcher de séchage, les recouvrir en utilisant une petite quantité de glycerol (33% = une partie de 100% de glycerol et deux parties d'eau). 3. Préparation Microslide Pour la préparation des lames permanentes suivantes, d'abord laver le glycérol loin de la section micro avec une pipette et de l'eau. Couvrir le mouillé soiction avec quelques gouttes de safranine (1 g de safranine poudre + 100 ml d'eau) et Astrablue (0,5 g de poudre bleu Astra + 2 ml de 100% d'acide acétique + 100 ml d'eau) pour distinguer entre lignifiées et non lignifiées structures, mais également pour améliorer le contraste pour l'analyse de l'image subséquente. Laissez la section reposer 5 min couverts par le colorant, puis le laver avec une pipette et de l'eau à nouveau. Dès que la teinture en excès est enlevé, déshydrater la section avec des pipettes en les lavant avec une séquence de 75% après dilution, 96% et enfin 100% d'éthanol. Utiliser des pipettes à rincer les échantillons sur la lame de verre au lieu de placer les échantillons dans un bain à réduire le temps de traitement à environ deux à trois minutes pour le processus de déshydratation entier. NOTE: La déshydratation de l'éthanol empêche échantillons fragiles de se casser. Rincez ensuite la section avec 100% xylène. NOTE: Le xylène est cancérogène et la ventilation est obligatoire dans le laboratoire lors de son utilisation. Autreproduits existent remplacent xylène, mais se il ya intention de stocker les échantillons sur de plus longues périodes de temps (années, décennies) pour une nouvelle analyse de potentiel, baume du Canada (étape 3.5.2) est le support que l'intégration qui reste clair sans changer de couleur au fil du temps. Malheureusement, le baume du Canada doit être utilisé en combinaison avec du xylol. Tant que le xylène devient laiteuse (blanchâtre), répétez le processus de déshydratation car il ne est pas suffisamment déshydraté. Dès que le xylène reste clair, couvrir la section avec une baisse de 100% du baume du Canada et le couvrir avec un verre de couverture d'au moins la taille de la section. NOTE: Soyez conscient de retirer les bulles d'air en appuyant doucement sur le couvercle en verre vers le bas. Placez le micro glissière qui en résulte entre les deux bandes en matières plastiques résistantes à la chaleur et le placer sur une plaque métallique. Placez un poids (par exemple, un aimant) sur le dessus de la diapositive à une pression pour maintenir la partie plate au cours du processus de séchage qui suit. Placer les lames dans un four à60 ° C pendant environ 12 heures. Après 12 h, prendre les diapositives du four et placez-les sur une étagère pour les laisser refroidir à la température ambiante (environ 20 ° C). Une fois refroidi, retirez le poids et la bande de plastique et nettoyer la lame en utilisant des lames de rasoir pour enlever l'excédent du baume du Canada. 4. Visualisation du contenu des cellules Préparer la solution Nawashin 25. Préparer une solution (A) avec 5 g d'acide chromique, 50 ml d'acide acétique à 96% et 320 ml d'eau désionisée. Préparer une autre solution (B) avec 200 ml de formol avec 175 ml d'eau désionisée. Mélanger la solution A et la solution B dans un rapport 1: 1 pour créer la solution Nawashin. Pour visualiser le contenu des cellules, fixer l'échantillon avec une solution Nawashin pendant 10 min pour arrêter tous les processus de dégradation dans la cellule. REMARQUE: La fixation préserve les noyaux des cellules permettant une estimation de longévité de cellule (cell = longévité de noyaux présents / absent noyaux, la présence or absence de noyau indique si la cellule est vivante ou morte). Après fixation, laver les sections avec de l'eau pour supprimer complètement la solution Nawashin avant de les colorer de bleu Safranin-Astra et avant de les colorer en outre avec le bleu picrique-aniline (1 partie saturé aniline soluble dans l'eau bleu + 4 parties d'acide picrique 10%) . Chauffez avec précaution l'échantillon à environ 80 ° C (dans tous les cas en dessous du point d'ébullition) pour accélérer le processus de coloration. Pour la déshydratation et l'incorporation des échantillons suivre le protocole étapes 3.4 à 3.8. 5. Préparer numériques Images de caractéristiques anatomiques Créez des images numériques de surfaces de base pour l'analyse de la cuve. Couper le plan de la surface du noyau à l'aide du microtome de base et tacher la surface noire résultante en utilisant simplement un feutre. Dès que le colorant est séchée, frotter la surface du noyau à la craie blanche. Appuyez sur la craie dans les cellules simplement en frottant la craie sur lesurface à l'aide d'un doigt. Aussi enlever l'excédent de la craie par cette procédure. NOTE: En conséquence, les parois cellulaires sont noires et les parties de lumière des vaisseaux sont blancs. Ce contraste est une condition préalable à une analyse d'image automatisé. Placer le noyau préparé ci-dessous un microscope binoculaire équipé d'un appareil photo numérique. Prendre une séquence d'chevauchant légèrement (env. 10%) à partir des images d'un côté de l'âme jusqu'à ce que toute la surface soit capturée. Assembler les images individuelles pour créer une image complète de la surface du noyau. Créez des images numériques à partir de micro diapositives Placez les micro nettoyés glisse sous un microscope et prendre des images qui se chevauchent de l'ensemble de la section. Définir un grossissement spécifique en fonction de la structure à analyser, compris entre 40X et 1,000X grossissement. Assembler les images simples pour créer une image complète de la section. Pour éviter les distorsions possibles pendant le processus de couture, utilisez "; Plan »-type lentilles de l'objectif avec le microscope. 6. Caractéristiques Quantifier anatomiques Pour détecter les cellules et les frontières de l'aide de l'anneau ROXAS18 image outil d'analyse ou un logiciel similaire, charger une image complète d'une section micro et l'étalonnage de l'spatiale associée à obtenir des résultats quantitatifs en unités métriques. Calculer la calibration spatiale en mesurant le nombre de pixels entre les échelles de images de scène micrométriques prises au même grossissement et en divisant la valeur obtenue par l'espacement échelle en unités métriques (par exemple 1 000 um). Sélectionnez dans la liste fournie (fourni dans le logiciel) une configuration appropriée avant de commencer la partie automatique de l'analyse. REMARQUE: Une configuration est un ensemble optimisé de paramètres précédemment de programme qui, par exemple, tient compte de la couleur de la coloration de l'échantillon et la taille et la forme des cellules gamme à détecter. Configurations adaptées ainsipermettra de produire des résultats de reconnaissance optimales pour différentes espèces et qualités d'image. Sélectionnez d'autres options telles que l'utilisation des régions de l'image qui doivent être inclus ou exclus pour éviter, par exemple, les marges ou des fissures d'images vides dans l'échantillon, si nécessaire. Lancer l'analyse en appuyant sur le bouton Analyser. Si opté, définir des régions de l'image qui doivent être inclus ou exclus en utilisant l'outil polygone, rectangle ou cercle. L'analyse de suivi automatique utilise des algorithmes flexibles pour corriger certaines lacunes de l'image (par exemple, une mauvaise contraste) et améliorer le contraste en fonction de la qualité de l'image.

Representative Results

Toutes les analyses dendroécologiques dépendent des échantillons précis, peu importe si disques, des noyaux ou micro noyaux sont prises. Pour cela, les appareils doivent être en parfait état (aiguisé précision) pour éviter les micro fissures dans l'échantillon en bois. Lors de la préparation des surfaces de carottes, l'utilisation d'un microtome de base est essentielle. La possibilité d'avoir des cellules ouvertes, qui peut encore être traités pour améliorer le contraste en analyse d'images et des mesures de la taille des navires (figure 1), est une première étape importante vers l'adaptation des structures anatomiques dans le temps des analyses de séries. Parfois, la densité d'un échantillon de bois dur empêche l'utilisation d'un microtome. Dans ce cas, un polissage approprié et l'élimination ultérieure de sciure de bois excessive des vaisseaux avec un compresseur ou sous vide est la meilleure option. Pour des analyses plus détaillées des structures cellulaires plus petits que le bois initial et trachéides du bois final chez les conifères, micro sections de haute qualité sont nécessaires. Ici, potentiartefacts al tels que les parois cellulaires secondaires étant arraché la nécessité de paroi primaire doit être évitée (Figure 2). Si ces artefacts apparaissent dans les images numériques, une analyse automatique des dimensions de la cellule ne est plus possible. Les artefacts doivent ensuite être corrigé manuellement, ce qui prend du temps et dans la plupart des cas, les résultats de mesures incorrectes de dimensions de la cellule. La simple application d'un fluide non-newtonien, ce est à dire, une solution d'amidon de maïs, à la partie supérieure de l'échantillon supporte la stabilité de la structure, tout en réduisant l'apparition d'artefacts à un minimum (figure 2) 26. Cette application d'amidon de maïs, adapté pour tous les échantillons de bois y compris les espèces tropicales, rend l'application de la procédure d'intégration aux échantillons avant de couper redondant. Micro sections permettent une détermination plus sécurisé des cernes annuels. Ce est particulièrement le cas pour les conifères de plus en plus sur leurs limites naturelles, à savoir </ Em>, à la limite des arbres dans les zones de haute montagne. Extrêmement anneaux étroits sont fréquentes et difficiles à détecter macroscopique (figure 3). Dans les cas extrêmes, les anneaux se composent d'une ou deux rangées de cellules de bois initial et une rangée de cellules aplaties bois final, qui manquent (par opposition à des cellules communes bois final) des parois cellulaires épaisses. Pour cela, ils sont mieux ou même visible que lorsque l'aide de micro sections. En outre, les fluctuations de densité peuvent être différenciés des limites de cernes plus clairement, ce qui simplifie la détection des anneaux annuels notamment en Méditerranée et dans les tropiques (figure 3). Lors de l'analyse des images avec un grossissement de 40X ou plus, des cellules individuelles peuvent être consultées et l'épaisseur de leurs parois cellulaires est également détectable. Logiciel semi-automatique analyse permet la mesure de paramètres spécifiques le long de chemins définis suivant la direction de leur évolution temporelle et spatiale (Figure 4). Avec cela, changes de paramètres simples tels que la lumière de cellules ou l'épaisseur de la paroi cellulaire peuvent être déterminées sur toute l'étendue d'un cycle annuel (Figure 4). Cela peut être fait pour tous les anneaux visibles dans l'image, ce qui soutient pleinement la nécessité d'une analyse étendue des séries chronologiques. Des analyses d'image peuvent également être utilisées pour déterminer les phases de développement des cernes annuels dans la période de végétation (figure 5). Lorsque l'on analyse l'image d'une coupe colorée avec Safranin et Astra bleu utilisant la lumière polarisée, même les différentes étapes de la lignification, en commençant dans les coins extérieurs des parois cellulaires jusqu'à la pleine lignification de la paroi cellulaire secondaire, devenir visible. Ce est parce que les murs lignifiée cellulaires (mature) brillent dans la lumière polarisée (figure 5). Des informations détaillées peut être liée à des données environnementales documentés pour la période de végétation respective pour déterminer par exemple un relati climat de croissance plus détaillée pionnat. Figure 1. Exemples d'une section micro et une surface plane prêt d'un chêne avec anneau de largeur et des vaisseaux mesures de taille gauche:. Extérieure partie d'un noyau de incrément de chêne. Le noyau 5 mm de diamètre a été coupé en utilisant un microtome de base. La surface a ensuite teinté noir avec un marqueur feutre et les cellules ont été remplis à la craie blanche après la tache était sec. A droite: le graphique est indiquant anneau de largeur et la taille de la cuve mesures effectuées sur la surface du coeur représenté sur la gauche. Aucun micro sections ont été nécessaires pour faire ces mesures en raison de la surface transparente créée par le microtome de base (modifié après le 21). En bas: la section Micro coupé un noyau d'incrémentation, taché, déshydraté et fixe au Canada baumier. Epaisseur: 20 pm, longueur: 25 cm. g "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2. Images de micro sections coupées sans stabilisation par rapport à une coupe de section en utilisant la solution d'amidon de maïs. A gauche: la section Micro montrant coupe artefacts dans les trachéides de bois initial d'un conifère. L'échantillon a été coupé sans enrobage et par conséquent, les parois secondaires plutôt minces des cellules du bois initial a été clivé de la paroi primaire (flèches bleues). A droite: la section Micro sans artefacts dans les trachéides de bois initial d'un conifère. Cette section (même échantillon, comme indiqué sur la gauche) a été coupé après l'application de la solution de la fécule de maïs avec une brosse sur le dessus de la surface de l'échantillon. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. ove_content "fo: keep-together.within-page =" always "> . Figure 3. Exemples de limites de cernes annuels peine détectables gauche: section Micro d'un noyau d'incrémentation (ici: Larix decidua) montrant une limite de bague (flèche noire) indiqué par une seule rangée de cellules du bois final aplaties sans épaississement des parois cellulaires. Cet anneau ne serait pas visible macroscopiquement. Droite: fluctuations de densité intra-annuels (flèche blanche) sont fréquents dans les espèces méditerranéennes (micro section: Quercus ilex). Le changement progressif de la structure de la cellule vers bois final et le dos à la structure bois initial (flèche blanche) permet de différencier les fluctuations de densité de limites de cernes réel (flèche noire). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "always"> Figure 4. Illustration de la zone de lumière et des mesures d'épaisseur de paroi dans un anneau annuel d'un conifère haut:. Découpe de votre image montrant un exemple de résultats de l'analyse ROXAS dans un arbre-anneau de Pinus sylvestris (pin sylvestre). frontières cycliques figurent en jaune et donne un aperçu des trachéides lumières en cyan. Pour un seul fichier radiale (bleu trachéides de lumières) mesurées les épaisseurs de paroi cellulaire est représentée par des cercles rouges. Noir barre d'échelle = 100 um. En bas:. Les changements intra-annuelles dans trachéide surface de la lumière et de l'épaisseur de la paroi cellulaire trachéide pour la totalité de l'anneau annuelle Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 5. example d'un anneau formant annuelle. L'image a été capturée sous un microscope optique en lumière polarisée d'un micro-section teinté Safranin et Astra bleu obtenue à partir d'un micro-carottes échantillonnées sur 7 Juillet 2007 à partir d'un Larix decidua croissante dans le Lötschental à 1300 m au dessus du niveau de la mer. Sur ce micro-section des cellules du cambium, les cellules dans la phase de l'élargissement, les cellules dans la phase d'épaississement et la paroi des cellules matures sont reconnaissables. La largeur tangentielle de l'image couvre ~ 1 mm de la section transversale du xylème. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Les défis d'une intégration réussie et durable de l'anatomie du bois dans la recherche dendroécologique sont, en dehors des problèmes analytiques multiples, principalement en raison des aspects techniques. Ces défis vont de l'échantillonnage principe approches à la création de micro sections de haute qualité et leur analyse ultérieure 19.

À première vue, l'échantillonnage des carottes ou même des disques est une procédure simple qui a été connu depuis de nombreuses années. Il ya beaucoup de choses qui peuvent être fait de mal et une petite inexactitude dans l'échantillonnage peut entraîner de graves problèmes pendant la préparation et l'analyse des phases ultérieures. Petites inexactitudes telles que carottage qui ne est pas exactement perpendiculaire à l'axe de tige ou en utilisant un carottier mal aiguisé ne sont pas un problème si le but de l'étude est limitée à sonner largeur mesures. Toutefois, lorsque l'objectif pour l'analyse microscopique des échantillons, une direction d'échantillonnage incorrecte pourrait entraîner des distorsions optiquesparois cellulaires, tandis que l'utilisation de carottiers contondants résultats dans les micro fissures dans le noyau. Par conséquent, lorsque vous essayez de couper micro sections de ces noyaux, les sections minces simplement se effondrer et une préparation efficace ne est plus garantie. La même chose est vraie pour les micro-carottage. Une pointe émoussée se traduira par haute pression lorsque le perforateur est martelé dans le bois de la tige. Par conséquent la couche cambiale sera compressé. Les cellules du cambium (figure 5) sont donc pressés et ne peuvent pas être analysés.

échantillonnage du disque est en effet la meilleure stratégie lors de l'analyse des variations de croissance pour les relier aux changements environnementaux. Malheureusement, il est tout simplement impossible de prendre des disques de tous les arbres destinés à être échantillonné pour d'autres analyses. Néanmoins, en particulier dans le cas de la dendrochronologie tropicale, une certaine quantité de disques souches est nécessaire en combinaison avec des carottes. Les disques sont utilisés comme base pour définir les limites du cycle et pour que cela se appuient l'boundars définies en fonction de l'analyse de carottes 12,27,28.

Les avantages et les inconvénients de ponçage par rapport coupe sont fréquemment discutés 1,11,21. Comme il est mentionné ci-dessus, la meilleure procédure dépend toujours de la question de recherche et les paramètres à analyser (macroscopique ou microscopique). Si les analyses isotopiques ou chimiques sont projetés dans une autre étape de travail, il est de la plus haute importance que la poussière abrasive créée par ponçage qui peuvent combler en lumières de cellules pendant la totalité de l'échantillon, est soigneusement éliminé par aspiration ou air de pression.

Couper micro sections est pour toutes les analyses microscopiques la façon la plus appropriée de la préparation des échantillons pour des analyses ultérieures. Tout d'abord, la section est coupée de l'échantillon, qui peut ensuite être conservée sans aucune contamination potentiels pour d'autres analyses. Deuxième ces sections permettent des mesures de haute résolution de paramètres de cellules uniques. En outre, en évitant l'incorporation de tempstechnique en utilisant une solution de fécule de maïs 26 pour stabiliser les cellules est un gros avantage en micro sectionnement.

Un inconvénient de micro sectionnement est encore la taille limitée de l'échantillon résultant en temps de préparation longues. Pour de vrai analyses de séries chronologiques remontant dans le temps au cours des siècles, voire des millénaires, il ya une nécessité de développer davantage les dispositifs existants de coupe 17,19, mais aussi traitement et d'analyse 18 image. Un premier pas dans cette direction est le développement du noyau microtome 21, initialement fabriqué pour couper les surfaces planes des noyaux (figure 1). Des tests récents ont révélé la possibilité de couper micro sections de carottes entières utilisant ce dispositif (Figure 1).

Micro sections de haute qualité fournissent le principe de base pour une analyse d'image efficace. Prenant les images sous un microscope est une procédure commune 19, mais leur analyse efficace est encore une tâche qui doitêtre développés 17. Tous les systèmes existants d'analyse d'images sont semi-automatiques, ce est à dire qu'ils doivent être plus ou moins intensément contrôlée par le technicien. Dans de nombreux cas, les images doivent être corrigées ou même de nouvelles images ont à faire pour améliorer le contraste pour un meilleur enregistrement des structures par le logiciel sans modification de l'épaisseur de la paroi cellulaire dans l'image.

Des outils d'analyse d'images spécialisées telles que ROXAS 18, WinCell ou son exécution spécifiques pour ImageJ 29 sont en mesure de fournir des données anatomiques de base tels que le nombre de cellules, la dimension de la cellule, l'épaisseur de la paroi cellulaire et la position de la cellule dans le cycle annuel. Beaucoup de paramètres anatomiques supplémentaires qui sont pertinents dans un contexte dendroécologique peuvent être calculées à partir de ces mesures de base tels que la taille des plus grands conduits, la distribution de taille des conduits, la taille du bois initial ou la première ligne de conduits, la densité (optique) de bois, intra-annuelle profils de taille de conduit et la paroi cellulaireépaisseur et de regroupement des modèles de conduits (solitaire, multiples, etc.).

Utilisation du logiciel ROXAS 18, les contours des lumières conduit (ce est à dire, de l'eau cellulaire d'orchestre) et les frontières annuels d'anneau sont automatiquement reconnus et représentés visuellement comme superpositions plus de l'image originale. algorithmes de détection pour les conduits sont basées sur la couleur, la taille et des informations de forme, les algorithmes de détection des frontières de l'anneau sur le contexte local de chaque conduit. Une boîte à outils nous permet d'améliorer manuellement ces résultats en éditant directement les caractéristiques de superposition, ce est à dire, suppression, ajout et la modification des frontières de l'anneau et le conduit décrit. Après l'édition, la sortie de données finale, y compris l'épaisseur de la paroi cellulaire (conifères), est automatiquement généré et sauvegardé dans un tableur. Entièrement systèmes automatisés sont pas actuellement disponibles, pas même pour les conifères montrant une structure relativement simple, mais ce est un objectif pour les développements futurs. Ce serait très favorable à l'full intégration de paramètres anatomiques de bois dans les séries chronologiques analyse.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge the effort of Sandro Lucchinetti (Schenkung Dapples, Zürich) for constructing the devices needed to guarantee progress in sample preparation.

Materials

Increment corer http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article
&id=57&Itemid=88&lang=en
Core-Microtome http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN
Laboratory microtome http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN
Trephor micro corer http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp
Nawashin solution Ten parts 1% chromic acid, four parts 4% formaldehyde and one part acetic acid
Picric-Anilin blue One part saturated aniline blue and four parts Trinitrophenol dissolved in 95% ethanol
Safranin Empirical Formula (Hill Notation) C20H19ClN4 
Astra-blue Empirical Formula (Hill Notation) C47H52CuN14O6S3 
Ethanol Linear Formula CH3CH2OH 
Xylol (Xylene) Linear Formula C6H4(CH3)2 
Canada Balsam Embedding solution for microscopy
Roxas Software http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN
ImageJ Software http://imagej.nih.gov/ij/
WinCell http://imagej.nih.gov/ij/
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References

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Gärtner, H., Cherubini, P., Fonti, P., von Arx, G., Schneider, L., Nievergelt, D., Verstege, A., Bast, A., Schweingruber, F. H., Büntgen, U. A Technical Perspective in Modern Tree-ring Research – How to Overcome Dendroecological and Wood Anatomical Challenges. J. Vis. Exp. (97), e52337, doi:10.3791/52337 (2015).
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