激光捕获显微切割 - 个人多巴胺神经元的分离和整个腹侧被盖区的示范

注：从小鼠脑组织使用符合卫生指南实验动物的护理和使用的国家机构，并研究方案被批准的机构动物护理和使用委员会在密西西比州立大学。 1.准备幻灯片和组织请使用硅烷准备幻灯片或聚邻苯二甲酸酯（PEN）膜的载玻片上。 对于RNA分离，在核糖核酸酶去污溶液浸幻灯片，洗3次，用无RNA酶的水，然后脱水以分级系列无RNase乙醇和真空干燥的30分钟。 使用低温恒温器切割组织切片在10微米厚度和安装的准备核糖核酸免费的幻灯片。保持切片保持RNA的质量在冻结部分。 注：可以肯定的组织是约4mm距滑动的LCM不能除去组织过于接近滑动的边缘的边缘。在奥德r以从PEN膜滑动除去组织，确保该组织是从左侧，顶部和底部4毫米和7毫米的右侧分别是膜的未附连到滑动的尺寸的幻灯片。 对于使用直接免疫组化，组织部分上任硅烷制备幻灯片或PEN膜幻灯片单个细胞群的隔离。使用间接免疫组织化学引导技术组织的区域隔离，安装一个套节上进行免疫组化和交替部分在任一的PEN膜滑动和/或硅烷制备型滑动硅烷制备型滑动用于LCM。 2.组织准备激光捕获 – 快速酪氨酸羟化酶免疫的免疫活性细胞的直接激光捕获大纲组织与疏水笔并晾干。 修复组织的丙酮 – 甲醇（1：1）溶液在-20℃下进行10分钟。 注：欧ř经验表明，丙酮 – 甲醇固定导致更一致的免疫比丙酮或甲醇单独。 在磷酸盐冲洗滑动缓冲盐水（PBS），用1％的Triton（无RNA酶）。 盖板部分与100-200微升的PBS，用1％的Triton与酪氨酸羟化酶抗体1：100稀释用400单位/毫升的RNasin。孵育5-10分钟。 简要地在PBS中漂洗两次和PBS-1％的Triton。 涵盖组织以100-200微升的山羊抗兔IgG标记的Alexa Fluor 488 1:100稀释在PBS-1％的Triton 400 U / ml的RNA酶抑制剂和50ng / ml的DAPI染色。孵育5分钟。 漂洗2次在PBS中再脱水30秒在一个分级系列的无RNA酶的乙醇（75％-75％-95％-95％-100％-100％）。 孵育在二甲苯洗涤两次，持续1分钟，然后5分钟。 去除二甲苯幻灯片之前立即用于LCM，并允许风干。 3.组织准备激光捕获 – 酪氨酸羟化酶免疫的免疫反应区的间接激光捕获过程一张幻灯片与相邻的部分路段安装在硅烷准备和/或PEN膜幻灯片进行免疫组化。 注意：此处所用的程序是类似于以前报道5。为示范的图像，所述二氨基联苯胺（DAB）发色反应物用于可视化感兴趣的酪氨酸羟化酶的神经元。 对于用于LCM幻灯片，定为5分钟，在100％的丙酮在4℃下。 脱水组织在分级一系列的RNase免乙醇（75％-75％-95％-95％-100％-100％），为每个1分钟。 孵育在二甲苯洗涤两次，持续1分钟，然后5分钟。 去除二甲苯幻灯片之前立即用于LCM，并允许风干。 4.使用激光捕获显微切割系统注：LCM应用程序有10个工具条和2个窗口控制显微切割的过程。工具栏：1.显微镜，2捕获激光，3.激光切割4.研究，5.导航，6材料，7捕获组，8显微切割，9字体，10注解。 Windows系统：1.实时视频和2路线图。 选择在LCM系统软件的材料工具栏上的“开门”选项卡开门。 负载幻灯片上的三个可用插槽。对于本演示中，载一张幻灯片与酪氨酸羟化酶免疫组化可视化与DAB，一是硅烷准备的幻灯片和一个PEN膜各打成快速荧光酪氨酸羟化酶免疫组化幻灯片。在典型的实验中，使用未标记的丙酮固定切片与标记为用DAB酪氨酸羟化酶或幻灯片直接标记荧光酪氨酸羟化酶用于激光捕获的参考幻灯片。 加载LCM帽到可用插槽。 注：宏和HS LCM盖可供使用。使用LCM帽的类型代暂时搁置于细胞或组织的量的数目被收集。宏幻灯片列出收集多达几千细胞的同时HS帽可以收集几百个。宏幻灯片让更多的组织收集，但需要50微升的裂解液。在HS帽，与适配器一起使用时，只需要10微升裂解缓冲液，它允许用于RNA的更大比例的恢复。 关门。 加载滑激活路地图窗口，它提供了整个滑动的工作图，这允许选择感兴趣的区域的（ 图3）。查看实时视频窗口中的路线图，导航到感兴趣的区域。 在材质的工具栏，通过检查上面的滑块槽框标识PEN膜的幻灯片。供应帽的属性，右键点击帽的材料工具栏，选择“帽供应的属性”。检查表示帽的位置的框，并选择任一马CRO或HS帽。 选择在显微镜工具栏上的“荧光”标签开启荧光灯及使荧光灯预热。使用蓝色和紫外线过滤器，以可视化的亚历克斯福陆公司488和DAPI分别。用“照相机调整”标签来增加，以便看到荧光标记的细胞的图像的灵敏度。 在材质的工具栏，右键单击一个上限，并将其移动到感兴趣的幻灯片。双击在路线图的某个位置选择出现在实时视频窗口的区域。通过选择路线图的区域（左键双击），然后右击并选择移动周围的上限幻灯片“在中心区域将帽。” 使用红外激光捕获前，瞄准和调整它的实力。放置在盖在滑动远离组织的区域。在捕获激光工具栏，选择“启用”。调整电源（3-100毫瓦），脉冲（100-1000000μ;秒）和＃命中激光。火IR激光器，当所述端盖上滑动，而不组织的一部分，并检查，以查看是否在激光充分地熔化LCM帽膜。 注意：这就是所谓的润湿被熔化聚合物膜在盖以便其接触载玻片。足够的润湿是可见的暗环稠合的环清除（参见图4的充不足熔点的例子）的中心滑动。如果润湿不充分，再次调整功率和脉冲，并测试火灾直到实现这一点。此外，也可以使用激光的多个探测器。 当红外激光强度进行调整，点击右键，选择“捕获激光是在这里”瞄准激光。 注：此步骤告诉那里的红外激光捕获的目的是在组织的计算机。瞄准激光的这一步骤是非常关键的，并且需要每个盖被移动时要重复或目标被改变。 </oL> 个人多巴胺神经元5.激光捕获显微切割掉硅烷准备幻灯片移动到感兴趣的区域，以捕获细胞。 注：分离多巴胺神经元的例子在这里示出。 要捕获离硅烷准备幻灯片的单个细胞，选择“LCM”选项卡，然后在“单点”，在显微切割工具栏中的图标。 在显微镜工具栏，使用“快门”标签荧光滤镜片荧光和明场之间进行切换，以选择合适的过滤器，并使用目标选项卡来改变倍率。一旦所感兴趣的细胞是在实时视频窗口中可见，调整用于所关注的细胞标记的细胞的大致尺寸的斑点尺寸。通过点击捕获激光工具栏然后点击一个染色细胞，然后通过点击在相反侧的一侧上的地点标签做到这一点。 注：此计算直径的光点，并显示该值。 通过点击它们而“单点”的图标被选择标记感兴趣的细胞。这样做是为了把一个点标记每个单元上。在这里，蓝色过滤器和10X物镜被用于可视化的多巴胺神经元。重新测试和瞄准红外激光的上限那里按照步骤4.9和4.10描述的是它下面的任何组织。 一旦细胞标记，请选择“进入 – 切割和捕获”显微切割工具栏和红外激光对标签会自动闪光选择的所有标记的​​细胞。此外，如果需要的话，手动触发的IR激光器的任何兴趣点（ 图5D）。 移动盖远离部和上滑动的开口区域，以检查是否将细胞捕获在LCM的帽。确保感兴趣的细胞是从滑动（ 图5B中的E）并连接到LCM盖（ 图5C中的F）。文档日过程是通过单击显微镜工具栏中的“捕获图像”选项卡上。 当收集完组织，去除帽帽右击并选择“移动到”，然后“卸载”。 个人多巴胺神经元6.激光捕获过PEN膜幻灯片捕捉到单个细胞脱落的同时使用红外和紫外激光器PEN膜的幻灯片，选择“剪切和捕捉”选项卡，在显微切割工具栏。选择“单点”标签来标记感兴趣的细胞。使用“剪切线”选项卡概述每个单元格。一定要测试的IR激光器如在步骤4.9和4.10中描述并测试UV激光，以确定认为必要削减最小强度在PEN膜和组织（ 图4和5） 选择显微切割工具栏上的“捕捉和剪切”选项卡。当使用这种技术收集个体细胞，是务必火IR激光器第一后跟UV激光，因为这些小片可以是当它们存在之前切出，以被固定到LCM盖丢失。 注意：此过程也可以通过烧制红外激光在兴趣点的手动完成并将细胞单独列出与紫外激光。 收集感兴趣的细胞后，如在步骤5.7如上所述，以确定是否被拆除和附连到所述盖（ 图6）的细胞移动的LCM帽。 当收集完组织，取下帽子用鼠标右键单击帽，选择“移动到”，然后“卸载”。 7.硅烷准备幻灯片捕获的腹侧被盖区来识别感兴趣的区域，则使用处理用于免疫组织化学的幻灯片。 注：对于本演示腹侧被盖区被隔离（ 图7A）。 加载LCM帽和测试激光作为步骤š4.9和4.10。 注意：通常情况下，一个宏LCM盖被使用，但一个协帽也可以使用（参见图8）。 为了隔离组织从硅烷准备幻灯片的区域（ 即腹侧被盖区），请在显微切割工具栏中的“LCM”选项卡，然后选择“多边形外观”选项卡。概述在实时视频窗口感兴趣的区域。根据收集的区域的大小，勾勒出在低放大倍数（2X目的）感兴趣区域。收集，但是，仪器使用10倍的目标，以便调整目标下，10倍的目标的红外激光之前捕获。 选择 – 在显微切割工具栏中的“去捕捉和切”选项卡。 注：计算机会自动闪光红外激光在整个所选区域（ 图7F，I）。如果液晶膜没有充分熔化整个区域中，激光可发射人ually或整个过程重复进行。 移动LCM帽从组织，以确定所述组织是如何好收集。 注：使用这种方法的一个典型的通过留下一些组织背后的幻灯片（见Figure7G）。如果发生这种情况，则重复选择和上述捕获步骤。重复这一步骤可以增加组织的收集（ 图7J）的量。 当收集完组织，卸帽通过右键点击帽，选择“移动到”，然后“卸载”。 8.捕获从PEN膜幻灯片的腹侧被盖区使用处理用于免疫组织化学的滑动为指导，以从上在PEN膜滑动如上所述组织选择感兴趣的区域。 选择在显微切割工具栏中的“剪切和捕捉”选项卡。选择“剪切线”选项卡，并使用免疫组勾勒出感兴趣区域米斯特里标记的幻灯片作为指导。 注：该程序会自动添加点的红外激光对组织附着到帽。使用“单点”选项卡中添加额外的点，以更好地保护组织的上限。 根据10倍的目标，试射和在4.9和4.10描述瞄准红外和紫外激光。测试该UV激光可以穿透细胞膜上滑动，并且该切口对应于计算机屏幕上的位置。使用紫外激光的强度是刚好足以切割的膜和组织，但不损伤所述组织（ 图5）。 选择 – 在显微切割工具栏中的“去捕捉和切”选项卡。 注：计算机会自动闪光的红外激光在组织中的所有标记点把它连接到盖那么火紫外激光切割幻灯片PEN膜和组织（ 图7C）。附加红外熔化点可能是必要的，以充分地附着在TIS告到LCM帽，这也可以手动添加。 移动LCM帽从组织，以确定是否将组织从部分（ 图7C）除去和附连到所述盖（ 图7C）。 当收集完组织，去除瓶盖，右键单击帽，然后选择“移动到”，然后“卸载”。 9.隔离的RNA 收集来自所捕获的细胞或组织的RNA，孵育在RNA裂解缓冲液中的LCM盖膜30分钟，在37℃。 注：对于HS帽，一个适配器可允许用于在盖的使用仅仅10微升裂解缓冲液和附加到0.5 ml离心管。宏帽要求50微升裂解缓冲液，并直接连接到0.5 ml离心管。 温育后，旋裂解缓冲液分解成0.5 ml离心管。 为了确保所有细胞Ø完全裂解ř组织，剥离瓶盖，发生在裂解液的LCM盖膜。 为了测试RNA的完整性，用RNA分离出剩余的后LCM测量RNA完整性幻灯片的组织。 注：由于与LCM获得的有限的样本的RNA，通常不实际的上LCM分离的RNA测试RNA的完整性，但是，从剩余的组织的RNA提供任何RNA降解的良好指标，由于在固定，免疫组织化学和时间LCM过程。