Eine ganze Zelle Bioreporter Ansatz für Transport und Bioverfügbarkeit von organischen Schadstoffen in Wasser Ungesättigte Systeme Bewerten
Summary
Whole-Cell-Assay mit Bioreporter Burkholderia sartisoli RP037-MCHe wurde entwickelt, um Bruchteile einer organischen Verunreinigung (dh fluoren) nach den aktiven Transport von Myzelien Überbrückungsluftgefüllten Poren in einer wasser ungesättigten Modellsystem für bakteriellen Abbau verfügbar zu detektieren.
Abstract
Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is not an appropriate measure for its availability; bioavailability rather depends on the dynamic interplay of potential mass transfer (flux) of a compound to a microbial cell and the capacity of the latter to degrade the compound. In water-unsaturated parts of the soil, mycelia have been shown to overcome bioavailability limitations by actively transporting and mobilizing organic compounds over the range of centimeters. Whereas the extent of mycelia-based transport can be quantified easily by chemical means, verification of the contaminant-bioavailability to bacterial cells requires a biological method. Addressing this constraint, we chose the PAH fluorene (FLU) as a model compound and developed a water unsaturated model microcosm linking a spatially separated FLU point source and the FLU degrading bioreporter bacterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe by a mycelial network of Pythium ultimum. Since the bioreporter expresses eGFP in response of the PAH flux to the cell, bacterial FLU exposure and degradation could be monitored directly in the microcosms via confocal laser scanning microscopy (CLSM). CLSM and image analyses revealed a significant increase of the eGFP expression in the presence of P. ultimum compared to controls without mycelia or FLU thus indicating FLU bioavailability to bacteria after mycelia-mediated transport. CLSM results were supported by chemical analyses in identical microcosms. The developed microcosm proved suitable to investigate contaminant bioavailability and to concomitantly visualize the involved bacteria-mycelial interactions.
Introduction
Boden ist dicht mit einer Vielzahl von Mikroorganismen, wie Bakterien 1,2 besiedelt. Jedoch Bedingungen in diesem Lebensraum sind anspruchsvoll, vor allem in Bezug auf die Verfügbarkeit von Wasser 3. Bakterien dauerhaft müssen für optimale Bedingungen in heterogenen Umgebungen 4 suchen, aber das Fehlen von kontinuierlichen Wasser Filmen führt zu eingeschränkter Mobilität 5 behindern sie frei verteilen. Auch sind Diffusionsraten von gelösten Stoffen (zB Nährstoffe) unter ungesättigten Bedingungen 6 gesenkt. So werden Bakterien und Nährstoffe oft physisch getrennt und Nährstoff Zugänglichkeit begrenzt ist 3. Als Folge könnte ein Transportvektor für chemische Verbindungen, die nicht einen kontinuierlichen Wasserphase erfordern, hilft, diese Einschränkungen zu überwinden. In der Tat haben viele Mikroorganismen wie Pilze und Oomyceten ein filamentöses Wachstum bilden damit sie durch luftgefüllten Porenraum wächst dadurch erreichen und mobi entwickeltlizing auch körperliche getrennt Nährstoffe 7 und 8 kohlenstoffhaltigen Substanzen über lange Distanzen. Sie können sogar als biologische Transportvektoren, die Zucker und andere Energiequellen, um Bakterien 9 liefern zu handeln. Aufnahme und dem Transport in Myzel Organismen wurde auch für hydrophobe organische Schadstoffe, wie polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) in Pythium ultimum 10 oder in arbuskulären Mykorrhizapilzen 11 gezeigt. Seit PAH sind allgegenwärtig und schlecht wasserlöslichen Verunreinigungen 12 im Boden könnte Mycel-vermittelten Transport helfen, Verunreinigung Bioverfügbarkeit für potenzielle Bakterien Abbauern erhöhen. Während der Gesamtbetrag der Schadstofftransport direkt durch chemische quantifizieren Mittel 10, die Bioverfügbarkeit von Schadstoffen durch Myzel zu abbauenden Bakterien und anderen Organismen transportiert nicht leicht zu beurteilen.
Das folgende Protokoll stellt eine Methode vor, um die Auswirkungen myce evaluierenlia auf Schadstoff Bioverfügbarkeit um bakterielle Abbauern in direkter Weise; sie ermöglicht das Sammeln von Informationen über die räumlich-zeitliche Auswirkungen von Schadstoffen auf die mikrobielle Ökosysteme. Wir beschreiben, wie Sie eine ausführliche ungesättigten Mikrosystem imitiert Luft-Wasser-Grenzflächen in Böden durch die Verknüpfung von ein physikalisch getrennt PAH Punktquelle mit PAK-abbauenden Bakterien Bioreporter über Myzel Transportvektoren. Weil Luftverkehr ausgeschlossen ist, kann die Wirkung der Myzel-basierten Transport auf PAH Bioverfügbarkeit für Bakterien in einer isolierten Art und Weise untersucht werden. Im Einzelnen wurden drei-Ring PAK Fluoren, das Myzel Organismus Pythium ultimum und die Bioreporter Bakterium Burkholderia sartisoli RP037-MCHe 13 in den beschriebenen Mikrokosmos Setups angewendet. Das Bakterium B. sartisoli RP037-MCHe wurde ursprünglich konstruiert, Phenanthren Flüsse an die Zelle 14 zu untersuchen und exprimiert enhanced green fluorescent protein (eGFP) als ein Ergebnis der PAH Flußmitteldie Zelle, während die rot fluoreszierende mCherry konstitutiv exprimiert wird. Detaillierte Informationen zu dem Reporter Bau von Tecon et al. 13 In Vorversuchen gegeben, zeigte das Bakterium keine Schwimmen und nur sehr langsam Schwarmfähigkeit. Es konnte sich langsam auf Hyphen von Pythium ultimum wandern, wenn als dichte Suspension wurde auf den Hyphen aufgebracht. Da Bakterien wurden in Agarose in dem folgenden Protokoll eingebettet ist, hat Migration auf Hyphen nicht auftritt.
Mit Hilfe der konfokalen Laserrastermikroskopie (CLSM) können die Bioreporter Bakterien direkt in den Mikrokosmen visualisiert werden und die Expression des eGFP kann in Bezug auf die Menge von Zellen (proportional zur mCherry Signal) mit Hilfe der Software ImageJ quantifizieren. Dies ermöglicht den Vergleich der Bioverfügbarkeit qualitativ in verschiedenen Szenarien (dh höher oder niedriger). FLU gefunden bioverfügbar nach Myzel Transport von P. zu sein ultimum (dh eshöher war als bei einer negativen Kontrolle). Außerdem wird das Protokoll beschreibt, wie die Gesamtmenge der Myzelien-vermittelte Transport über chemische Mittel zu quantifizieren und Verunreinigung Bioverfügbarkeit Überprüfung mittels silikonbeschichteten Glasfasern (SPME-Fasern) in identischen Mikrokosmen. Ergebnisse mit diesem Mikrokosmos Setup veröffentlicht wurden und für die Kombination von P. diskutiert ultimum, Fluoren und B. sartisoli RP037-MCHe 15. Hier liegt der Fokus auf einer detaillierten Beschreibung und Methode der Identifizierung von möglichen Gefahren des Protokolls, dieses Wissen für mögliche weitere Anwendungen. Weitere Anwendungen kann es sich um verschiedene Pilz-, Bakterien- Spezies (zB von verunreinigten Standorten), und andere Verunreinigungen (zB Pestizide) oder schadstoffVersorgung (zB, im Alter von Böden).
Protocol
Representative Results
Discussion
Die vorgestellte Mikrokosmos Setup als geeignet, um die Bioverfügbarkeit von räumlich getrennten Chemikalien abbauenden Organismen nach der Aufnahme und den Transport von Myzel zu studieren. Potenzielle Gasphasentransport von teilweise flüchtigen Verbindungen verhindert und bakterielle Bioreporter Zellen können ohne aufwändige Probenvorbereitung mit minimaler Störung des sensiblen System visualisiert und somit werden. Gleichzeitig kann die chemische Analyse der Probe leicht durchgeführt werden was eine gute Kontr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding by the German Environmental Foundation (DBU) is acknowledged. The authors thank Ute Kuhlicke for technical help with CLSM analysis and Birgit Würz, Rita Remer, and Jana Reichenbach for skilled experimental help. The authors would particularly like to thank Prof. Jan Roelof van der Meer and Dr. Robin Tecon for fruitful discussion and providing the bioreporter strain. It contributes to the ‘Chemicals in the Environment’ (CITE) research program of the Helmholtz Association.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP5X, LAS AF – Version 2.6.1; or equivalent CLSM | |
| GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD | Agilent | an equivalent GC/MS may be used | |
| GC capillary column J&W 121-5522 | Agilent | ||
| Cork borer | Fisher Scientific | 12863952 | or any other |
| Cover slips | Marienfeld | 107222 | High performance, No.1.5H |
| GC/MS insterts | WICOM | WIC 47080 | |
| GC/MS vials 2 ml | WICOM | WIC 41150 | |
| Lids / septa for screw cap vials | DIONEX | 49463 / 049464 | |
| Lids for GC/MS vials | WICOM | WIC 43948/B | |
| Objective Slides | Menzel | ordinary | |
| PDMS coated glass fibers | Polymicro Technologies, Inc. | V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µL m-1 | |
| Petri Dishes small / big | Greiner | 633-102 / 628-102 | |
| Screw cap vials 40 ml | DIONEX | 48783 | other glass vials may be used |
| Screw cap vials 60 ml | DIONEX | 48784 | other glass vials may be used |
| Acenaphthylene d08 | Dr. Ehrenstorfer | C 20510100 | |
| Acetone | Carl Roth | 9372.2 | |
| Activated carbon | Sigma-Aldrich | 242276-1kg | |
| Agarose | Carl Roth | 2267.4 | |
| Fluorene | Fluka | 46880 | |
| Kanamycin sulfate | Carl Roth | T832.2 | 50 mg L-1 |
| Methanol | Carl Roth | P7171 | |
| Minimal Medium: | 100 mL solution 1 + 25 mL solution 2 + 5 mL solution 3 ad. 1000 mL aqua dest | ||
| Solution 1 | |||
| Ammonium sulfate | Carl Roth | 3746.1 | 5 g L-1 |
| Magnesium chloride x 6 H2O | Carl Roth | 2189.1 | 1 g L-1 |
| Calcium nitrate x 4 H2O | Carl Roth | P740.1 | 0.5 g L-1 |
| Solution 2 | |||
| Disodium phosphate | Carl Roth | P030.1 | 55.83 g L-1 |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | 20 g L-1 |
| Solution 3 | pH 6.0 | ||
| Disodium EDTA | MERCK | 1084180250 | 0.8 g L-1 |
| Iron(II) chloride x 4 H2O | MERCK | 1038610250 | 0.3 g L-1 |
| Cobalt(II) chloride x 6 H2O | Carl Roth | T889.3 | 4 mg L-1 |
| Manganese(II) chloride x 1 H2O | Carl Roth | 4320.2 | 10 mg L-1 |
| Copper(II) sulfate | Carl Roth | P023.1 | 1 mg L-1 |
| Sodium molybdate x 2 H2O | Carl Roth | 0274.1 | 3 mg L-1 |
| Zinc chloride | MERCK | 1088160250 | 2 mg L-1 |
| Lithium chloride | Carl Roth | P007.1 | 0.5 mg L-1 |
| Tin(II) chloride x 2 H2O | Carl Roth | 4473.1 | 0.5 mg L-1 |
| Boric acid | Riedel-de-Haen | 11606 | 1 mg L-1 |
| Potassium bromide | Carl Roth | A137.1 | 2 mg L-1 |
| Potassium iodide | Carl Roth | 6750.1 | 2 mg L-1 |
| Barium chloride | Carl Roth | 4453.1 | 0.5 mg L-1 |
| MMA | Minimal medium + agarose 0.2 % | ||
| Phenanthrene d10 | Dr. Ehrenstorfer | C 20920100 | |
| Potato Dextrose Agar: | 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5 %; pH 6.8 | ||
| Potato Dextrose broth | Difco/ Beckton Dickinson | 254920 | |
| Bacto-agar | Difco/ Beckton Dickinson | 214040 | |
| Sodium acetate x 3 hydr. | Carl Roth | 6779.1 | |
| Sodium sulfate | MERCK | 1066495000 | |
| Toluene | MERCK | 1083252500 | |
| mTY medium: | 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl | ||
| Yeast extract | Merck | 1037530500 | |
| Tryptone | Serva | 4864702 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| imageJ with logi tool plugin | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10 | ||
| Pythium ultimum strain 67-1 | Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
| Burkholderia sartisoli RP037-mChe | Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland |
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