Une approche Cell biorapporteur entières pour évaluer transport et la biodisponibilité des contaminants organiques dans les systèmes insaturés eau
Summary
Toute une analyse de biorapporteur cellulaire avec Burkholderia sartisoli RP037-MCHE a été développé pour détecter fractions d'un contaminant organique (par exemple, le fluorène) disponible pour la dégradation bactérienne après le transport actif par mycéliums de pontage des pores remplis d'air dans un système de modèle insaturé de l'eau.
Abstract
Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is not an appropriate measure for its availability; bioavailability rather depends on the dynamic interplay of potential mass transfer (flux) of a compound to a microbial cell and the capacity of the latter to degrade the compound. In water-unsaturated parts of the soil, mycelia have been shown to overcome bioavailability limitations by actively transporting and mobilizing organic compounds over the range of centimeters. Whereas the extent of mycelia-based transport can be quantified easily by chemical means, verification of the contaminant-bioavailability to bacterial cells requires a biological method. Addressing this constraint, we chose the PAH fluorene (FLU) as a model compound and developed a water unsaturated model microcosm linking a spatially separated FLU point source and the FLU degrading bioreporter bacterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe by a mycelial network of Pythium ultimum. Since the bioreporter expresses eGFP in response of the PAH flux to the cell, bacterial FLU exposure and degradation could be monitored directly in the microcosms via confocal laser scanning microscopy (CLSM). CLSM and image analyses revealed a significant increase of the eGFP expression in the presence of P. ultimum compared to controls without mycelia or FLU thus indicating FLU bioavailability to bacteria after mycelia-mediated transport. CLSM results were supported by chemical analyses in identical microcosms. The developed microcosm proved suitable to investigate contaminant bioavailability and to concomitantly visualize the involved bacteria-mycelial interactions.
Introduction
Le sol est densément peuplé par une large gamme de micro-organismes tels que les bactéries 1,2. Cependant, les conditions dans cet habitat sont difficiles, notamment en termes de disponibilité de l'eau 3. Les bactéries ont besoin en permanence à la recherche de conditions optimales dans des environnements hétérogènes quatre, mais l'absence de films d'eau continues se traduit par une mobilité restreinte 5 les empêchant de se propager librement. En outre, les taux de diffusion de solutés (par exemple, les éléments nutritifs) sont abaissés dans des conditions insaturés 6. Ainsi, les bactéries et les nutriments sont souvent physiquement séparés et l'accessibilité des éléments nutritifs est limitée 3. Par conséquent, un vecteur de transport pour des composés chimiques qui ne nécessite pas une phase aqueuse continue peut aider à surmonter ces limitations. En fait, de nombreux micro-organismes tels que les champignons et oomycètes ont développé une forme de croissance filamenteuse leur permettant de se développer à travers les pores remplis d'air et atteindre ainsi mobilizing aussi physique nutriments 7 et 8 substances carbonées séparé sur de longues distances. Ils peuvent même agir comme des vecteurs de transport biologiques qui fournissent des sucres et d'autres sources d'énergie à 9 bactéries. Absorption et le transport dans les organismes de mycélium a également été montré pour les polluants organiques hydrophobes tels que les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) dans Pythium ultimum 10 ou à 11 champignons mycorhiziens. Depuis HAP sont des contaminants solubles dans l'eau omniprésents et mal 12 dans le sol, le transport de mycélium médiation pourrait aider à augmenter la biodisponibilité des contaminants bactériens pour dégradeurs potentiels. Considérant que le montant total de transport de contaminants peut être quantifiée directement par des moyens chimiques 10, la biodisponibilité des contaminants transportés par mycélium bactéries dégradant et d'autres organismes ne peut être évaluée facilement.
Le protocole suivant présente une méthode pour évaluer l'impact de mycelia sur la biodisponibilité des contaminants bactériens à dégradeurs d'une manière directe; il permet la collecte d'informations sur l'impact spatio-temporelle des contaminants sur les écosystèmes microbiens. Nous décrivons comment mettre en place un système de microcosme insaturé élaborée imitant interfaces air-eau dans le sol en reliant une source ponctuelle de HAP séparés physiquement avec biorapporteur bactéries HAP dégradants par des vecteurs de transport mycéliens. Parce que le transport aérien est exclu, l'effet du transport mycélium basée sur les HAP biodisponibilité pour les bactéries peut être étudié de manière isolée. Dans le détail, le RP037-MCHE de trois anneaux HAP fluorène, l'organisme mycélium Pythium ultimum et de la bactérie Burkholderia biorapporteur 13 ont été appliquées dans les configurations décrites microcosme. La bactérie B. sartisoli RP037-MCHE a été construit pour étudier phénanthrène flux à la cellule 14 et exprime améliorées protéine fluorescente verte (eGFP) à la suite de la HAP aux fluxla cellule, alors que la fluorescence rouge mCherry est exprimé de façon constitutive. Des informations détaillées sur la construction rapporteur est donnée par Tecon et al. 13 Dans les tests préliminaires, la bactérie n'a pas révélé de natation et seulement la capacité d'essaimage très lent. Il a été en mesure de migrer lentement hyphes de Pythium ultimum lorsqu'il est appliqué comme une suspension dense sur le dessus des hyphes. Comme les bactéries ont été intégrés dans l'agarose dans le protocole suivant, la migration sur les hyphes n'a pas eu lieu.
En utilisant la microscopie confocale à balayage laser (CLSM), les bactéries biorapporteur peuvent être visualisées directement dans les microcosmes et l'expression de eGFP peut être quantifiée par rapport à la quantité de cellules (proportionnelle au signal mCherry) à l'aide de la ImageJ logiciel. Ce permet de comparer la biodisponibilité qualitativement différents scénarios (ce est à dire, supérieur ou inférieur). FLU est révélée être biodisponible après le transport du mycélium de P. ultimum (ie, ilétait plus élevé que dans un contrôle négatif). En outre, le protocole décrit comment quantifier la quantité totale de transport de mycélium à médiation par des moyens chimiques et de vérifier la biodisponibilité des contaminants en utilisant des fibres de verre revêtu de silicium (fibres SPME) dans des microcosmes identiques. Résultats en utilisant cette configuration microcosme ont été publiés et discuté pour la combinaison de P. ultimum, le fluorène et B. sartisoli RP037-MCHE 15. Ici, l'accent est mis sur une description détaillée de la méthode et l'identification des pièges potentiels du protocole de fournir cette connaissance pour d'autres applications potentielles. D'autres applications peuvent impliquer différents fongique, espèces bactériennes (par exemple, provenant de sites contaminés), et d'autres contaminants (par exemple, les pesticides) ou d'un contaminant d'alimentation (par exemple, les sols âgés).
Protocol
Representative Results
Discussion
La configuration du microcosme présenté est avéré approprié pour étudier la biodisponibilité des produits chimiques spatialement séparés pour les organismes après absorption et le transport par mycélium dégradant. Potentiel de transport en phase gazeuse de composés volatils en partie est empêchée et les cellules bactériennes biorapporteur peut être visualisé sans préparation de l'échantillon complexe, et donc avec une perturbation minimale du système sensible. Dans le même temps, l'analyse …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding by the German Environmental Foundation (DBU) is acknowledged. The authors thank Ute Kuhlicke for technical help with CLSM analysis and Birgit Würz, Rita Remer, and Jana Reichenbach for skilled experimental help. The authors would particularly like to thank Prof. Jan Roelof van der Meer and Dr. Robin Tecon for fruitful discussion and providing the bioreporter strain. It contributes to the ‘Chemicals in the Environment’ (CITE) research program of the Helmholtz Association.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP5X, LAS AF – Version 2.6.1; or equivalent CLSM | |
| GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD | Agilent | an equivalent GC/MS may be used | |
| GC capillary column J&W 121-5522 | Agilent | ||
| Cork borer | Fisher Scientific | 12863952 | or any other |
| Cover slips | Marienfeld | 107222 | High performance, No.1.5H |
| GC/MS insterts | WICOM | WIC 47080 | |
| GC/MS vials 2 ml | WICOM | WIC 41150 | |
| Lids / septa for screw cap vials | DIONEX | 49463 / 049464 | |
| Lids for GC/MS vials | WICOM | WIC 43948/B | |
| Objective Slides | Menzel | ordinary | |
| PDMS coated glass fibers | Polymicro Technologies, Inc. | V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µL m-1 | |
| Petri Dishes small / big | Greiner | 633-102 / 628-102 | |
| Screw cap vials 40 ml | DIONEX | 48783 | other glass vials may be used |
| Screw cap vials 60 ml | DIONEX | 48784 | other glass vials may be used |
| Acenaphthylene d08 | Dr. Ehrenstorfer | C 20510100 | |
| Acetone | Carl Roth | 9372.2 | |
| Activated carbon | Sigma-Aldrich | 242276-1kg | |
| Agarose | Carl Roth | 2267.4 | |
| Fluorene | Fluka | 46880 | |
| Kanamycin sulfate | Carl Roth | T832.2 | 50 mg L-1 |
| Methanol | Carl Roth | P7171 | |
| Minimal Medium: | 100 mL solution 1 + 25 mL solution 2 + 5 mL solution 3 ad. 1000 mL aqua dest | ||
| Solution 1 | |||
| Ammonium sulfate | Carl Roth | 3746.1 | 5 g L-1 |
| Magnesium chloride x 6 H2O | Carl Roth | 2189.1 | 1 g L-1 |
| Calcium nitrate x 4 H2O | Carl Roth | P740.1 | 0.5 g L-1 |
| Solution 2 | |||
| Disodium phosphate | Carl Roth | P030.1 | 55.83 g L-1 |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | 20 g L-1 |
| Solution 3 | pH 6.0 | ||
| Disodium EDTA | MERCK | 1084180250 | 0.8 g L-1 |
| Iron(II) chloride x 4 H2O | MERCK | 1038610250 | 0.3 g L-1 |
| Cobalt(II) chloride x 6 H2O | Carl Roth | T889.3 | 4 mg L-1 |
| Manganese(II) chloride x 1 H2O | Carl Roth | 4320.2 | 10 mg L-1 |
| Copper(II) sulfate | Carl Roth | P023.1 | 1 mg L-1 |
| Sodium molybdate x 2 H2O | Carl Roth | 0274.1 | 3 mg L-1 |
| Zinc chloride | MERCK | 1088160250 | 2 mg L-1 |
| Lithium chloride | Carl Roth | P007.1 | 0.5 mg L-1 |
| Tin(II) chloride x 2 H2O | Carl Roth | 4473.1 | 0.5 mg L-1 |
| Boric acid | Riedel-de-Haen | 11606 | 1 mg L-1 |
| Potassium bromide | Carl Roth | A137.1 | 2 mg L-1 |
| Potassium iodide | Carl Roth | 6750.1 | 2 mg L-1 |
| Barium chloride | Carl Roth | 4453.1 | 0.5 mg L-1 |
| MMA | Minimal medium + agarose 0.2 % | ||
| Phenanthrene d10 | Dr. Ehrenstorfer | C 20920100 | |
| Potato Dextrose Agar: | 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5 %; pH 6.8 | ||
| Potato Dextrose broth | Difco/ Beckton Dickinson | 254920 | |
| Bacto-agar | Difco/ Beckton Dickinson | 214040 | |
| Sodium acetate x 3 hydr. | Carl Roth | 6779.1 | |
| Sodium sulfate | MERCK | 1066495000 | |
| Toluene | MERCK | 1083252500 | |
| mTY medium: | 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl | ||
| Yeast extract | Merck | 1037530500 | |
| Tryptone | Serva | 4864702 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| imageJ with logi tool plugin | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10 | ||
| Pythium ultimum strain 67-1 | Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
| Burkholderia sartisoli RP037-mChe | Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland |
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