ككل نهج Bioreporter خلية لتقييم النقل والتوافر الحيوي للملوثات العضوية في أنظمة غير المشبعة المياه
Summary
ووضعت كله فحص bioreporter زنزانة مع بوركهولدريا sartisoli RP037-mChe للكشف عن الكسور من الملوثات العضوية (أي fluorene) المتاحة للتدهور البكتيري بعد النقل النشط من قبل فطر سد المسام المليئة الهواء في نظام نموذجي غير المشبعة بالمياه.
Abstract
Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is not an appropriate measure for its availability; bioavailability rather depends on the dynamic interplay of potential mass transfer (flux) of a compound to a microbial cell and the capacity of the latter to degrade the compound. In water-unsaturated parts of the soil, mycelia have been shown to overcome bioavailability limitations by actively transporting and mobilizing organic compounds over the range of centimeters. Whereas the extent of mycelia-based transport can be quantified easily by chemical means, verification of the contaminant-bioavailability to bacterial cells requires a biological method. Addressing this constraint, we chose the PAH fluorene (FLU) as a model compound and developed a water unsaturated model microcosm linking a spatially separated FLU point source and the FLU degrading bioreporter bacterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe by a mycelial network of Pythium ultimum. Since the bioreporter expresses eGFP in response of the PAH flux to the cell, bacterial FLU exposure and degradation could be monitored directly in the microcosms via confocal laser scanning microscopy (CLSM). CLSM and image analyses revealed a significant increase of the eGFP expression in the presence of P. ultimum compared to controls without mycelia or FLU thus indicating FLU bioavailability to bacteria after mycelia-mediated transport. CLSM results were supported by chemical analyses in identical microcosms. The developed microcosm proved suitable to investigate contaminant bioavailability and to concomitantly visualize the involved bacteria-mycelial interactions.
Introduction
وذات الكثافة السكانية العالية التربة عن طريق مجموعة واسعة من الكائنات الدقيقة مثل البكتيريا 1،2. لكن الأوضاع في هذه الموائل تشكل تحديا، ولا سيما من حيث توافر المياه 3. البكتيريا تحتاج بشكل دائم للبحث عن الظروف المثلى في البيئات غير المتجانسة 4، ولكن عدم وجود أفلام المياه مستمرة يسفر عن التنقل محدود 5 تعوق لهم لنشر بحرية. أيضا، يتم خفض معدلات انتشار المواد المذابة (على سبيل المثال، والمغذيات) في ظل ظروف غير المشبعة 6. وهكذا، والبكتيريا والمواد المغذية وغالبا ما يفصل جسديا وسهولة الوصول إليها المغذيات يقتصر 3. ونتيجة لذلك، يمكن لناقلات النقل للمركبات الكيميائية التي لا تتطلب المرحلة المياه مستمرة تساعد على التغلب على هذه القيود. في الواقع، قد وضعت العديد من الكائنات الدقيقة مثل الفطريات والفطريات البيضية شكل النمو الخيطية تمكينهم من النمو من خلال مساحات مليئة بالهواء المسام وبالتالي الوصول إلى وموبيLIZING أيضا المادية فصل المواد المغذية 7 و 8 المواد الكربونية لمسافات طويلة. حتى أنها قد تكون بمثابة موجهات النقل البيولوجية التي توفر السكريات ومصادر الطاقة الأخرى للبكتيريا 9. وقد تبين أيضا امتصاص والنقل في الكائنات أفطوري للملوثات العضوية مسعور مثل الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (PAH) في Pythium ultimum 10 أو في الفطريات مايكورهيزال arbuscular 11. منذ PAH هي الملوثات في كل مكان وسيئة للذوبان في الماء 12 في التربة، والنقل بوساطة فطر قد يساعد على زيادة التوافر البيولوجي الملوثات البكتيرية للdegraders المحتملة. في حين أن المبلغ الإجمالي للنقل الملوثات يمكن قياسها كميا مباشرة الكيميائية يعني 10، التوافر البيولوجي للملوثات نقلها بواسطة فطر المهينة البكتيريا وغيرها من الكائنات لا يمكن تقييمها بسهولة.
يعرض بروتوكول التالية طريقة لتقييم أثر myceليا على التوافر البيولوجي الملوثات إلى degraders البكتيرية بطريقة مباشرة. لأنها تتيح جمع المعلومات عن تأثير الزماني المكاني من الملوثات الميكروبية على النظم الإيكولوجية. نحن تصف كيفية إنشاء نظام مصغر غير المشبعة تفصيلا محاكاة واجهات بين الهواء والماء في التربة عن طريق ربط مصدر نقطة PAH فصل جسديا مع bioreporter البكتيريا PAH المهينة عبر ناقلات النقل أفطوري. لأنه يتم استبعاد النقل الجوي، وتأثير النقل على أساس أفطوري على الهيئة العامة للإسكان التوافر الحيوي للبكتيريا يمكن دراستها بطريقة معزولة. في مزيد من التفاصيل، تم تطبيق ثلاثة عصابة PAH fluorene، الكائن فطر Pythium ultimum وbioreporter بكتيريا بوركهولدريا sartisoli RP037-mChe 13 في الاجهزة مصغرة وصفها. بكتيريا B. شيد sartisoli RP037-mChe أصلا لدراسة تدفقات فينانثرين إلى الخلية 14 وتعرب عن تعزيز الأخضر البروتين الفلوري (EGFP) نتيجة لتدفق الهيئة العامة للإسكان لالخلية، في حين أن الاستشعاع الأحمر يتم التعبير عن mCherry جوهري. وترد معلومات مفصلة عن بناء مراسل كتبها TECON وآخرون 13 في الاختبارات الأولية، وكشف البكتيريا لا السباحة وفقط بطيئة للغاية القدرة يحتشدون. كان قادرا على الهجرة ببطء على خيوط من Pythium ultimum عند تطبيقه كما وقف كثيفة على الجزء العلوي من خيوط. منذ جزءا لا يتجزأ من البكتيريا في الاغاروز في البروتوكول التالي، لم الهجرة على خيوط لا يحدث.
باستخدام متحد البؤر المجهري المسح الضوئي ليزر (CLSM)، والبكتيريا bioreporter يمكن تصور مباشرة في عوالم مصغرة والتعبير عن EGFP يمكن قياسها كميا بالنسبة لكمية من الخلايا (متناسبة مع إشارة mCherry) مع مساعدة من يماغيج البرمجيات. وهذا يسمح بمقارنة التوافر البيولوجي نوعيا في سيناريوهات مختلفة (أي أعلى أو أقل). تم العثور على FLU أن يكون بيولوجيا بعد نقل فطر من قبل P. ultimum (أي أنهكان أعلى مما كانت عليه في المراقبة السلبية). وعلاوة على ذلك، يصف بروتوكول كيفية تحديد المبلغ الإجمالي النقل بوساطة فطر عبر الوسائل الكيميائية وللتحقق من التوافر البيولوجي الملوثات باستخدام الألياف الزجاجية المغلفة السيليكون (الألياف SPME) في عوالم مصغرة متطابقة. النتائج باستخدام هذا الإعداد مصغرا وقد نشرت ومناقشتها لمزيج من P. ultimum، fluorene وB. sartisoli RP037-mChe 15. هنا، يكمن في التركيز على وصف طريقة مفصلة وتحديد المخاطر المحتملة للبروتوكول لتوفير هذه المعرفة لتطبيقات أخرى محتملة. قد تنطوي على مزيد من التطبيقات الفطرية المختلفة والأنواع البكتيرية (على سبيل المثال، من المواقع الملوثة)، وغيرها من الملوثات (مثل مبيدات الآفات) أو الملوثات إمدادات (على سبيل المثال، والتربة الذين تتراوح أعمارهم بين).
Protocol
Representative Results
Discussion
أثبتت الإعداد مصغرة عرض مناسب لدراسة التوافر البيولوجي للمواد الكيميائية فصل مكانيا للكائنات بعد امتصاص ونقل بواسطة فطر مهينة. يتم منع المحتملين النقل طور الغاز من مركبات طيارة جزئيا ويمكن تصور الخلايا البكتيرية bioreporter دون إعداد العينات تفصيلا وبالتالي مع الحد الأ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding by the German Environmental Foundation (DBU) is acknowledged. The authors thank Ute Kuhlicke for technical help with CLSM analysis and Birgit Würz, Rita Remer, and Jana Reichenbach for skilled experimental help. The authors would particularly like to thank Prof. Jan Roelof van der Meer and Dr. Robin Tecon for fruitful discussion and providing the bioreporter strain. It contributes to the ‘Chemicals in the Environment’ (CITE) research program of the Helmholtz Association.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP5X, LAS AF – Version 2.6.1; or equivalent CLSM | |
| GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD | Agilent | an equivalent GC/MS may be used | |
| GC capillary column J&W 121-5522 | Agilent | ||
| Cork borer | Fisher Scientific | 12863952 | or any other |
| Cover slips | Marienfeld | 107222 | High performance, No.1.5H |
| GC/MS insterts | WICOM | WIC 47080 | |
| GC/MS vials 2 ml | WICOM | WIC 41150 | |
| Lids / septa for screw cap vials | DIONEX | 49463 / 049464 | |
| Lids for GC/MS vials | WICOM | WIC 43948/B | |
| Objective Slides | Menzel | ordinary | |
| PDMS coated glass fibers | Polymicro Technologies, Inc. | V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µL m-1 | |
| Petri Dishes small / big | Greiner | 633-102 / 628-102 | |
| Screw cap vials 40 ml | DIONEX | 48783 | other glass vials may be used |
| Screw cap vials 60 ml | DIONEX | 48784 | other glass vials may be used |
| Acenaphthylene d08 | Dr. Ehrenstorfer | C 20510100 | |
| Acetone | Carl Roth | 9372.2 | |
| Activated carbon | Sigma-Aldrich | 242276-1kg | |
| Agarose | Carl Roth | 2267.4 | |
| Fluorene | Fluka | 46880 | |
| Kanamycin sulfate | Carl Roth | T832.2 | 50 mg L-1 |
| Methanol | Carl Roth | P7171 | |
| Minimal Medium: | 100 mL solution 1 + 25 mL solution 2 + 5 mL solution 3 ad. 1000 mL aqua dest | ||
| Solution 1 | |||
| Ammonium sulfate | Carl Roth | 3746.1 | 5 g L-1 |
| Magnesium chloride x 6 H2O | Carl Roth | 2189.1 | 1 g L-1 |
| Calcium nitrate x 4 H2O | Carl Roth | P740.1 | 0.5 g L-1 |
| Solution 2 | |||
| Disodium phosphate | Carl Roth | P030.1 | 55.83 g L-1 |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | 20 g L-1 |
| Solution 3 | pH 6.0 | ||
| Disodium EDTA | MERCK | 1084180250 | 0.8 g L-1 |
| Iron(II) chloride x 4 H2O | MERCK | 1038610250 | 0.3 g L-1 |
| Cobalt(II) chloride x 6 H2O | Carl Roth | T889.3 | 4 mg L-1 |
| Manganese(II) chloride x 1 H2O | Carl Roth | 4320.2 | 10 mg L-1 |
| Copper(II) sulfate | Carl Roth | P023.1 | 1 mg L-1 |
| Sodium molybdate x 2 H2O | Carl Roth | 0274.1 | 3 mg L-1 |
| Zinc chloride | MERCK | 1088160250 | 2 mg L-1 |
| Lithium chloride | Carl Roth | P007.1 | 0.5 mg L-1 |
| Tin(II) chloride x 2 H2O | Carl Roth | 4473.1 | 0.5 mg L-1 |
| Boric acid | Riedel-de-Haen | 11606 | 1 mg L-1 |
| Potassium bromide | Carl Roth | A137.1 | 2 mg L-1 |
| Potassium iodide | Carl Roth | 6750.1 | 2 mg L-1 |
| Barium chloride | Carl Roth | 4453.1 | 0.5 mg L-1 |
| MMA | Minimal medium + agarose 0.2 % | ||
| Phenanthrene d10 | Dr. Ehrenstorfer | C 20920100 | |
| Potato Dextrose Agar: | 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5 %; pH 6.8 | ||
| Potato Dextrose broth | Difco/ Beckton Dickinson | 254920 | |
| Bacto-agar | Difco/ Beckton Dickinson | 214040 | |
| Sodium acetate x 3 hydr. | Carl Roth | 6779.1 | |
| Sodium sulfate | MERCK | 1066495000 | |
| Toluene | MERCK | 1083252500 | |
| mTY medium: | 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl | ||
| Yeast extract | Merck | 1037530500 | |
| Tryptone | Serva | 4864702 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| imageJ with logi tool plugin | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10 | ||
| Pythium ultimum strain 67-1 | Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
| Burkholderia sartisoli RP037-mChe | Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland |
References
- Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
- Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
- Wang, G., Or, D. Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces. Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).
- Griffin, D. M., Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. . Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. , 141-151 (1981).
- Papendick, R. I., Camprell, G. S., Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. . Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. , 1-22 (1981).
- Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi. J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).
- Jennings, D. H. Translocation of solutes in fungi. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).
- Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).
- Furuno, S., et al. Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).
- Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots. Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).
- Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).
- Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability. Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).
- Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes. Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).
- Schamfuss, S., et al. Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).
- Smibert, R. M., Krieg, R. M., Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B., et al. . Manual of methods for general bacteriology. 19, 409-443 (1981).
- Wu, C. H., Warren, H. L. Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability. Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Pedersen, C., Sylvia, D., Mukerji, K. G. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. Handbook of Vegetation Science. Vol. 19, 195-222 (1996).
- Furuno, S., et al. Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems. Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).
