Calibré Forceps modèle de compression de la moelle épinière des blessures

Toutes les procédures animales et les méthodes de protection des animaux doivent être approuvés par Institutional Animal Care and Usage Comité de l'institution (IACUC). 1. Préparation chirurgicale Assemblez tous les outils chirurgicaux et des réactifs nécessaires: pinces, ciseaux Vana roungeurs, écarteur, scalpels, ciseaux, des sutures, des agrafes de la peau, Q-tips, une solution saline stérile, éponges chirurgicales, et isoflurane. Préparer et autoclave un pack complet d'outils chirurgicaux avant la chirurgie. Si des opérations chirurgicales sur plus d'une souris, et l'autoclave préparer un paquet d'outils par animal, ou une autoclave paquet d'instruments chirurgicaux et stériliser avec un stérilisateur à outil entre dans des interventions chirurgicales. En général, un paquet d'outils stérilisés peut être utilisé sur jusqu'à 5 souris si un outil terilizer de billes de verre est utilisé pour nettoyer les outils entre-deux chirurgies (après cinq animaux les outils doivent être re-nettoyé et stérilisé avant utilisation). Se il vous plaît vérifier avec votre administrateur local pour IACUC institutisur les lignes directrices spécifiques. Stériliser le champ opératoire avec 70% tampons imbibés d'alcool isopropylique. Mettre en place des champs opératoires pour assurer un champ stérile est maintenue pendant la chirurgie. Peser chaque souris avant la chirurgie. Administrer une dose de 0,05 mg / kg de poids corporel de la buprénorphine, la voie sous-cutanée. Anesthésier l'animal par l'administration d'isoflurane à une dose de 4% dans la chambre d'aspiration de la machine isoflurane. Une fois que l'animal est anesthésié, appliquer une pommade pour les yeux pour éviter la déshydratation, réglez l'animal sur un coussin chauffant à 37 ° C, et de veiller à ce que la tête de la souris est correctement situé dans le cône d'anesthésie. (Remarque: Utilisez une source de chauffage qui ne sera pas causer des brûlures thermiques, à savoir, une couverture de circulation d'eau, bouteille d'eau chaude, ou équivalent..) A ce stade, administrer une dose de 2% d'isoflurane à l'animal. Raser la surface dorsale de la souris, à environ 1 cm autour de l'emplacement d'incision prévue. Désinfecter l'incision site par lavage avec 70% de tampons imbibés d'alcool isopropylique, puis avec une solution d'iode (10% de povidone-iode, de 1% d'iode disponible). Répétez 3 fois. 2. Dorsale laminectomie Avant de faire une incision, se assurer que l'animal est correctement anesthésié en vérifiant les réflexes à l'aide de la méthode de pincement orteil ou queue. Faire une incision le long de la colonne vertébrale dorsale avec un scalpel et la lame, puis vérifier les réflexes à nouveau. Cambrer le dos pour aider à bien visualiser des repères, tels que les frontières entre les vertèbres. Couper à travers la peau. Insérez écarteur pour maintenir la peau et le fascia arrière de la moelle épinière. Vider le tissu de chaque côté de la moelle épinière pour exposer les muscles couvrant la colonne vertébrale. NOTE: Le chirurgien doit être familier avec les repères anatomiques. Par exemple, l'angle inférieur de l'omoplate correspond à T7. Le sommet de la courbe naturelle de la colonne vertébrale de la souris est T12 et peut être utilisé comme point de référence. Avec péclairage Roper, déterminer l'espace entre les vertèbres. Trouver l'extrémité postérieure de T10 et couper les muscles et le fascia perpendiculaire à l'espace disque intervertébral. Coupez juste assez pour exposer le processus et postérieure lamina épineuse de T10. En utilisant une paire de fine pointe de Dumont # 5 pince, retirer une partie du tissu de la lame et apophyse épineuse pour exposer une petite tranche de la moelle épinière. Lorsque cela est nécessaire, utiliser une pince de tissu pour stabiliser la colonne vertébrale. Effectuez la laminectomie en insérant un côté d'une paire de petits ciseaux de Vana le long du côté dorsolatéral de la vertèbre et juste sous la lame. Faire de petites cisailles prudentes pour couper à travers le côté latéral de la lame vertébrale. Se assurer qu'aucune pression ne est appliquée à la moelle épinière. Répéter l'opération sur l'autre côté. Appliquez une légère pression pour stopper le saignement si nécessaire avec un Q-tip ou une éponge chirurgicale, en prenant soin de ne pas appliquer une pression sur la moelle épinière. NOTE: Préparer la mousse de geltrempé dans une solution saline stérile dans le cas où les besoins de la coagulation à contrôler. Une fois que les incisions ont été faites, soulevez la face dorsale de la vertèbre et effacer doucement toutes les pièces jointes de tissus. Utiliser les moyens appropriés pour contrôler les saignements si nécessaire. 3. compression de la moelle épinière Utilisation roungeurs ou forceps laminectomie, en sorte que les côtés latéraux de la moelle épinière sont exempts d'os vertébral de sorte que les pinces calibrées pour la blessure de compression peuvent situer de part et d'autre de la moelle épinière. Les bras de la pince doivent être capables d'être placés dans l'espace épidural sur des côtés adjacents de la moelle épinière et les pointes de la pince doit être capable d'atteindre le fond du canal vertébral. Assurez-vous que la visibilité de la moelle épinière est bon. Situer le Dumont # calibré 5 forceps approximativement au milieu du segment exposé de la moelle épinière. Rappelons que les bras de la forceps doit être placé dans l'espace épidural sur les côtés adjacents et les conseils doit toucher le sol du canal vertébral pour générer blessures reproductibles. Comprimer soigneusement la moelle épinière jusqu'à ce que les entretoises relient. Maintenir en place pendant 15 sec. Relâchez doucement la force de compression et retirer la pince calibrés de la moelle épinière. Une solution saline stérile doit être utilisé pour retrouver l'homéostasie avant la plaie est fermée. 4. Blessure clôture Suturer soigneusement la couche de muscle dans la moelle épinière, en prenant soin de ne pas perturber ou appliquer une pression sur la moelle épinière. Utilisez soit des sutures ou des agrafes pour fermer la peau sur la plaie. Si vous utilisez gaz anesthésique, commencer à diminuer / désactiver l'anesthésique. Administrer 0,1 ml de sonneries lactate par 10 g de poids corporel pour aider compte de déshydratation au cours de la chirurgie et après la chirurgie lorsque l'animal est léthargique et la récupération de la blessure. La solution doit être warmed à la température du corps avant l'injection. Placez la souris dans une cage sans literie. La cage doit reposer sur le dessus d'un patin chauffant (comme décrit dans 1.1.5) d'une manière qui permet à la moitié de la surface de la cage pour être sur le patin, tandis que l'autre moitié est en appui sur une contre-RT, pour donner le options de climat souris une fois qu'il est ambulatoire. Prenez soin de veiller à ce que la «cage de récupération" est situé dans un environnement calme. Surveiller de près l'animal jusqu'à ce qu'il a repris conscience, au moment où la souris peut être transféré à une cage régulière avec literie. 5. Soins post-opératoire Après la chirurgie, administrer une dose de 0,05 mg / kg de poids corporel buprénorphine sous-cutanée toutes les 12 h pour les 3 premiers jours après la chirurgie, puis au besoin pour gérer les symptômes de la douleur. Administrer une dose de sonneries lactate (0,1 ml par 10 g de poids corporel sous-cutanée) pour les 3 premières – cinq jours après la chirurgie. Donnez cette dose si / quand l'uniMAL commence à montrer des signes de déshydratation en dehors de cette période initiale. Exprimer manuellement la vessie des animaux à l'aide de la manoeuvre Crede deux fois par jour. Palper doucement l'abdomen de l'animal pour localiser la vessie, puis appliquer une pression à la baisse doux jusqu'à ce que la vessie est vide. Si la vessie ne se vide pas ou l'urine est sanglante ou trouble, administrer 50 mg / kg du poids corporel de Baytril à l'animal par injection intrapéritonéale pendant 10 jours. Surveiller les animaux pour des signes de autophagie, la déshydratation et la perte de poids excessive (supérieure à 20% du poids corporel). Si un animal présente un de ces symptômes se il vous plaît consulter un vétérinaire immédiatement en ce qui concerne les options de traitement, ou euthanasier l'animal d'une manière humaine suivant les lignes directrices du IACUC. Étant donné que la mobilité peut être limitée à droite après la chirurgie, prendre les mesures nécessaires pour se assurer que les animaux ont accès à la nourriture et de l'eau. Préemballés nourriture humide, ainsi qu'unes hydrogel, peut être mis à la disposition des animaux dans ces cas. 6. Évaluer les lésions tissulaires résultant de la compression des blessures Anesthésier animaux comme décrit dans les étapes 1.4 et 1.5. Contrôler la profondeur de l'anesthésie par pincement de l'orteil et le suivi des réflexes de clignotement de la cornée. Lorsque l'animal est insensible aux stimuli, passez à l'étape 6.2. Effectuer une perfusion intracardiaque 10. Exposer la cavité thoracique et insérer une aiguille dans le ventricule gauche. Rincer fluides existants avec 20 – 30 ml de phosphate refroidie à la glace une solution saline tamponnée (PBS), suivi par 15 à 25 ml de glace-froid 4% de paraformaldehyde (PFA). Retirer la moelle épinière. Couper la dorsale de la peau à la moelle épinière et de déblayer tout excès de tissu entourant la longueur de la colonne vertébrale. Accise colonne vertébrale et coupé tout tissu restant. Le niveau réel de la laminectomie et ie préjudice peut être confirmé par le comptage des nervures. Utilisez des ciseaux et des pinces Vanna pour déplacer de petites sections de la colonne vertébrale dans une direction caudale à rostre. Continuer à couper jusqu'à ce que le cordon est exposé suffisamment pour permettre l'élimination sûre. Visualisation de l'emplacement et de la découpe peut être facilitée par l'utilisation d'un stéréoscope. Placez le tissu de la moelle épinière dans 4% PFA. Permettre au tissu d'après-fix dans cette solution pendant 24 heures à 4 ° C. Cryoprotect tissu par incubation dans 30% de saccharose pendant 24 heures à 4 ° C. Incluez tissu dans octobre En bref, prendre le tissu de l'incubation de saccharose à 30% et de supprimer tout excès de solution. Placez le tissu dans un cryomoule rempli d'octobre et incuber pendant 1 h à 4 ° C. Éliminer les moisissures de 4 ° C, confirmer orientation directionnelle du tissu, mettez le moule dans un plat peu profond de 2-méthylbutane (pré-réfrigérée pendant 1 heure sur de la glace sèche) et laissez octobre se solidifier complètement. Gardez sur glace sèche si vous utilisez immédiatement ou store à -80 ° C. Coupez le tissu en 20 sections um sagittal l'aide d'un cryostat. Mont tissus directement sur diapositives. Stocker à -20 ° C jusqu'à utilisation. Effectuer hématoxyline et de l'éosine (H & E) tache. Brièvement, réhydrater le tissu (5 min, deux fois), tache avec hématoxyline (2,5 min), et laver avec de l'eau (1 min, 2 fois). Incuber dans un tissu 50%, puis 70% d'éthanol (3 min à chaque fois), de la teinture avec de l'éosine (45 sec), et déshydrater par incubation à 90% (5 s), 95% (5 s), 100% d'éthanol (2 min) et l'isopropanol (2 min). Effacer avec du xylène (5 min, 3 fois). REMARQUE: coloration H & E varie en fonction de l'épaisseur du tissu et des conditions spécifiques. Par conséquent, la normalisation est nécessaire avant de procéder à des échantillons de tissus expérimentaux. Couvrir le tissu avec une mince bande de Permount (~ 100 um) et lamelle. Appuyez sur tous les côtés de la lamelle pour assurer une bonne distribution de fluide. Laissez sécher diapositives O / N. Visualize coupes de tissus en utilisant un microscope et images de capture numérique en utilisant le logiciel d'accompagnement.