高分子の3次元再構成のための試料調製のプライマーおよび高品質データ収集：クライオ電子顕微鏡ののいいことといけないことをやる

1.クライオホルダーの準備およびメンテナンス注：ドライポンプステーション、ターボポンプステーションと1つ以上のコールドステージコントローラからなるが、主に3つの目的のために使用した：a）それは、それらが使用されていないときにクライオホルダを格納するための安全な場所である。所有者を格納するための正しい方法は、真空下駅でそれらを残すことである。 b）は、液体窒素デュワーから取り出し、クライオホルダの先端が露出したときに発生する霜や湿気の蓄積を蒸発すること。これは、ウォームアップサイクルで達成される。 C）ゼオライト乾燥剤を再生するために、とcryoholderデュアーで高真空を達成すること。これは、低温電子顕微鏡法を行う際に、一定の温度を保持する必要がある。 ウォームアップサイクル。 ポンプ場のポンプポートのいずれかにクライオホルダーを挿入します。ホルダーの真空バルブの下に金属コンセントに避難管の1をフック。作る駅（V1、V2、およびV3）上及びクライオホルダー上のすべてのバルブが閉じていることを確認してください。 コー​​ルドステージコントローラをオンにして、制御コードを介してホルダーに接続します。ターボポンプ場の電源スイッチをオンにします。 コー​​ルドステージコントローラ内のウォームアップサイクル·オプションを起動します。ターボポンプ場における真空は10 -3トルまたはより良いを読み取ると、バタフライバルブV2を開き、真空が安定するまで待ってから、バタフライ弁V1を開きます。 ホルダー内の温度が20℃以上で安定するまで約30分間ウォームアップサイクルを実行します。 [閉じるV1、およびサイクルを停止します。 ゼオライトサイクル。 4時間とO / N CryoEMセッションの前に、そして週に一度使用しない場合においてゼオライトサイクルを実行します。 ゼオライトサイクルオプションを起動し、1〜2×10 -4トルの範囲で、良好な真空を達成するために必要な時間を選択し、したがって、長いホールド時間。真空10 -3に達するとトールは、デュワー排気バルブ、V3を開きます。ポンプステーションは、その後ホルダーに行を避難されます。真空が安定するまで待ちます。 クライオホルダーのバルブを開きます。ホルダーのバルブは、V3、V2、および最終的にV1：サイクルが完了すると、それらがオープンされた逆の順序で弁を閉じる。ターボポンプ場とコールドステージコントローラの電源を切り、コールドステージコントローラとターボポンプ場からクライオホルダーを外してください。 2.グリッドの準備クリーニング。 注：商業ホーリーグリッドを使用する際には、製造工程で使用された残留ポリマーを除去するために、使用前にそれらをきれいにすることが推奨される。一番下に敷設ろ紙の5層のガラスシャーレにこれを行います。 ホーリー炭素側を上にして濾紙上にグリッドを配置します。 ガラスパスツールピペットを用いて、数滴Oで紙を濡らすグリッドの周りにFクロロホルム、彼らは単に浮動開始するまで。 ヒュームフードO / Nでわずかに開いた蓋をペトリ皿をカバーしています。 NOTE：氷層に直接穴あきカーボングリッド内の小孔を横切って形成することができるように薄いカーボン担体（2.2〜2.3ステップ）を省略することができる。 ピンセットを使用して、2つの新たな表面を露出するために雲母の一部を切断する。ペトリ皿に白い紙に雲母フェイスアップの新たな露出面を配置します。 カーボン蒸発器のベルジャーでペトリ皿を置きます。真空は、2×10 -6トル未満になるまでのシーケンスをポンプダウンし始める。炭素棒の表面上の不純物を揮発させ、被覆されたペトリ皿で​​予備蒸発を行う。その後ベルジャーを放送し、ペトリ皿からカバーを取り外します。 真空はカーボンの薄層（〜5 nm）を持つマイカは10 -6トルとコートを下回るまでポンプダウンシーケンスを実行します。炭素中に眼の保護を使用して、蒸発。マイカシートの下に置かれていた紙に生じた闇に炭素膜の厚さを監視します。 TEMグリッドに炭素薄膜を転送します。 被覆された雲母の0.5×1cmの部分をカットし、ろ過し、脱イオン水の平らな表面上に炭素から浮上。平らな水面を取得するために、光学レンズペーパーを使用してください。ピンセットを使用して、浮遊炭素層の上面に接して、グリッドの穴あきカーボン側を入れて、それを拾う。 グリッドの十分な数が用意されるまで、ステップ2.3.1と2.3.2を繰り返します。 グロー放電。 NOTE：グロー放電は、親水性にグリッドの天然に疎水性炭素被覆層に変換する。この手順はオプションです。 炭素側はパラフィルムで覆われた7.5×2.5センチのガラススライド上に上向きにグリッドを配置します。グロー放電装置のチャンバにそれを置き、チャンバーを閉じます。 ポンプ25ミリアンペアで20秒、7×10 -2ミリバールのためのベルジャーとグロー放電。 注：この時間の間に光紫色の輝きが見えるようになる。グリッドとのスライドガラスを削除し、1時間以内にそれらを使用し、そうでなければ、彼らは再び放電グローする必要があります。 3.サンプルプランジ凍結注：液体窒素とエタン飛沫から保護するために、この機器を使用する際、安全メガネと適切な靴を使用してください。 プランジ​​凍結装置の電源をオンにします。蒸留水で加湿器リザーバーを記入してください。所望の温度に設定された相対湿度及びブロット時間の条件を急落、ブロット力と吸着時間（22°C、95％、2秒、ここに示した例における2及び40秒）。新しいブロッティング濾紙を置きます。 安定性（約10分）達成されるまで液体窒素で外側容器を充填することによってエタン容器を冷却する。液体窒素はboilin停止するとGは、内側チャンバー内エタンタンクからのチューブの先端を配置し、非常にゆっくりとバルブを開きます。内室にエタンを液化して、上から1ミリメートルにそれを埋める。エタンを凍結しないでください。注意：エタンが極めて引火性と爆発性のある。 ピンセットは、装置の凍結プランジ内に整列していることを確認します。 湿度の電源をオンにします。ピンセット上にグリッドをロードし、ホーリーグリッドの炭素表面（鈍い側）にサンプルの3-5μlのをロードします。薄い液体層を達成するためにグリッドに吸着し、ブロッティングを行うために、サンプルを待ちます。 液体エタンにそれを沈めることで、グリッドをフラッシュ凍結。着実にピンセットを保持する液体エタンからピンセット·グリッドアセンブリを取り外し、液体窒素で外室に移す。液体窒素中に浸漬し、小さなグリッドボックスにグリッドを転送します。貯蔵タンクのいずれかへの転送中に液体窒素中ですべての時間をガラス化したサンプルを維持することを確認してくださいまたはクライオホルダーに。 注：グリッドボックスは、少なくとも1年間の大容量（35〜50 L）、液体窒素デュワー内に格納することができる。収納に便利な、彼らは2と50ミリリットルファルコンチューブに配置することができます上部とデュワーの口から引き出すことができる、そのキャップに添付釣り糸で穴を掘削。 4. TEMにクライオグリッドを転送クライオ転送ワークステーションにクライオホルダーを挿入します。挿入中にホルダーの先端を傷つけないように注意してください。任意の光学レンズペーパーでそれを削除がある場合は、ルーペを使ってロッドとクライオホルダーのOリング上の小さな繊維や粉塵の存在を確認してください。 クライオホルダーのデュワー、液体窒素で、ワークステーションの容器を埋める。ワークステーションが付属して閉じ込められたロートを用いて液体窒素をこぼさないようにしてください。 温度を監視するためのコールドステージコントローラにクライオホルダーを接続し、液体窒素＆＃を追加し続ける160、温度が約-194℃で安定するまで。液体窒素のレベルがワークステーション容器とクライオホルダーデュワー内の両方の真空シールのレベルの下にあることを確認します。グリッドピンセット、クリップリングとワークステーション上のクリップリングツールの平滑末端を事前に冷却する。また、大規模なピンセットのセットと、液体窒素で満たされた別のデュワーでドライバーを事前に冷却する。 すぐに大規模なピンセットを使用してワークステーションでの液体窒素に凍結し、水和グリッドを含む低温グリッドボックスを転送する。ドライバーで低温グリッドボックスを開き、凍結された水和したグリッドを取り、試料ホルダースロットに配置します。 グリッドの上にクリップリングを置き、静かにそれがしっかりと所定の位置に固定されるまでクリップリングツールの平滑末端でそれを押してください。クライオシャッターを閉じます。ワークステーションからツールや低温グリッドボックスを外します。 ミニするために、顕微鏡コンソールにホルダーとグリッド全体のワークステーションを移動室内空気中のグリッドの転送時間をマイズ。 以前に充填され、少なくとも20分間冷却された液体窒素、とTEM抗contaminator締めくくり。 -60℃に顕微鏡ステージをプレチルト。 注：ホルダは、エアロックの中に挿入されるように、これは、液体窒素の損失を最小にする。 顕微鏡の事前ポンプエアロック·サイクルを開始します。電子銃にバルブが閉じていることを確認します（それはFEG TEMである場合は特に）。ポンプ前エアロックシーケンスはクライオホルダーを挿入する前に（約2分）を終了するのを待ちます。 注：これは消滅しているステージ上の赤い光で示されます。 エアロックにホルダーを挿入し、90°時計回りに回転させる。温度を監視するためにクライオホルダーにコールドステージコントローラコードを接続します。赤色光が消えるまで、再び待機し、TEMのハイテクにホルダーを挿入するために戻って0°位置にステージとホルダーの両方を回転させるGH真空コラム。 温度が決して、結晶氷の形成を回避するために-160℃以上になっていないことを確認してください。 クライオホルダーのデュワーを補充。ホルダーが熱平衡化し、TEMの真空が画像を記録する前に回復するまで45分 – 15を待ちます。 液体窒素のバブリングが検出された場合には、液体窒素の充填高さを変更し、または穏やかに綿棒でバブリング原点に触れる。 5.低線量データの収集注：低用量のデータ収集技術は/Å2 20電子への曝露を制限することにより、試料に電子線損傷を最小限に抑えるために使用される。これは、3つの構成の間で交互にすることにより達成される：高倍率（〜150,000X）と小さい視野、および「露光」で、低倍率（〜5,000倍）、ビュー、「フォーカス」の幅広い分野で、「検索」、所望の最終マグニ付きfication及び関心領域を含むが記録される。モード間でのビームブランク。 TEMおよび低用量プログラムを設定クライオシャッターを撤回し、カラムバルブを開きます。 舞台を中心に、15°±段階を揺するためにアルファワブラーを使用してユーセントリックの高さ（Z）を設定します。ステージが揺れている間に目立った動きがなくなるまでのZ位置を調整します。低用量のプログラムをアクティブにして、各モードの検出器を選択します。 露出モードでは、炭素を有さないグリッドの領域を見つける記録する領域が完全に照明されるように、最適なコンデンサ絞りとスポットサイズを選択することによって、照明を調整します。 overcondensation方向にビームを広げるようにしてください。 検索モードでは、より高い倍率で容易に識別されます小さな機能を見つける。露光モードでは、ジョイスティック（のxyステージコントローラ）でこの機能をセンタリング。偉業あれば低倍率で起動しますUREは視野にありません。 検索モードでは、低用量のxy画像シフトコントロールを使用して、フィールドの中央には、この機能をもたらす。 （ – 3ミクロン0.5）露出モードに移動し、それが記録されるエリア外になるまで、ジョイスティックを使用して傾斜軸に沿って機能を移動します。モードを集中し、XY画像シフトコントロールを使用して機能を中央に移動します。特徴は視野にない場合に低倍率で起動します。 常に中心としたビームにしてください。 データ収集クライオシャッターを撤回し、カラムバルブを開きます。低用量プログラムを起動します。 検索モードでは、薄い、均質な氷を含むグリッドの正方形を識別する。 適切な穴を選択し、フィールドの中央に配置します。モードを集中し、画像の焦点に切り替えます。 4.5ミクロン – 0.5間の画像アンダーフォーカス。 露出モードに切り替えて、画像を記録する。 5.2.3-5.2.4モードを検索し、手順を繰り返して切り替えます。記録する前露光良い穴を避け、グリッドの正方形を横切って移動する。 グリッドの正方形を終了し、別の良い1に移動する。 高さ（Z）を再調整し、データ収集を継続する。