Primer per immunoistochimica su Cryosectioned Rat tessuto cerebrale: Esempio colorazione per Microglia e neuroni

L'immunoistochimica è un processo per rilevare antigeni (cioè proteine) in sezioni di tessuto utilizzando anticorpi primari che si legano specificamente agli antigeni di interesse. L'immunoistochimica è stato lanciato da JR Marrack nel 1934, quando decise che gli anticorpi possano localizzare gli antigeni con grande specificità ^1. A partire dal 1942, tra i primi studi in vitro con anticorpi fluorescenti per visualizzare immunoistochimica sono stati pubblicati ^2,3, dopo di che il primo studio in vivo istochimico è stato pubblicato ^4. Durante il 1960, tre decenni dopo l'inizio dei metodi di immunoistochimica, gli anticorpi enzima-coniugati cominciarono ad essere usati come reagenti secondari. Questi metodi sono stati contemporaneamente e indipendentemente sviluppate in Francia e negli Stati Uniti ^5,6. Oggi, una vasta gamma di anticorpi fornisce infinite possibilità per gli studi di immunoistochimica ^7.

"> L'obiettivo generale di questa corrispondenza è quello di fornire una breve introduzione in immunoistochimica, ma non vuole essere una rassegna completa ed esaustiva di questa tecnica Nel metodo descritto, tecniche di immunoistochimica per due antigeni sono presentati (marker di microglia e. neuroni) per la colorazione di paraformaldeide perfuso, saccarosio crioprotetti, cervello di ratto cryosectioned. La colorazione immunoistochimica inizia con il blocco vincolante per ridurre la colorazione di fondo aspecifica antigene. Successivamente, l'incubazione con l'anticorpo primario consente per il legame ad un antigene specifico nel tessuto. Dopo l'anticorpo primario, un altro anticorpo, chiamato anticorpo secondario, viene applicato per collegare l'anticorpo primario a un segnale di visualizzazione coniugato ^8. L'anticorpo secondario obiettivi delle immunoglobuline G (IgG) dominio specifico per le specie in cui l'anticorpo primario è stato sollevato. L'anticorpo secondario amplifica il segnale dell'anticorpo primario poiché le regioni Fab di tegli anticorpi legano secondario a più siti sul dominio IgG dell'anticorpo primario. O enzimi o molecole fluorescenti coniugate alle regioni _c F dell'anticorpo secondario consentono la visualizzazione. Per esempio, un anticorpo primario anti-Iba1 coniglio è un coniglio IgG molecola specifica per Iba1. Quando IgG anti-coniglio asino viene applicato come anticorpo secondario, sarà riconoscere e legarsi a più regioni dell'anti Iba1-IgG di coniglio (vedere Figura 1). L'anticorpo asino può essere visualizzata con vari metodi. Questa corrispondenza concentra sulla rilevazione di un fluoroforo coniugato con l'anticorpo secondario, che riconosce l'anticorpo primario, per la visualizzazione mediante microscopia a fluorescenza. In immunoistochimica fluorescente, una macchia nucleare come Hoechst o DAPI può essere utilizzato per visualizzare tutti i nuclei.

Figura 1: SchRappresentazione ematico di vs diretta tecniche di etichettatura di anticorpi indiretto. Gli anticorpi legano all'antigene di interesse e può essere amplificata da anticorpi secondari sollevate contro la specie degli anticorpi primari. Questa tecnica può essere eseguita utilizzando complesso avidina-biotina (ABC) per l'amplificazione e DAB per la visualizzazione (A), o di un anticorpo secondario fluorescente direttamente coniugato (B). In alternativa, gli anticorpi primari possono essere coniugati direttamente con molte etichette diverse, tra cui la biotina o un fluoroforo (C). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Un metodo alternativo per la visualizzazione di colorazione immunoistochimica utilizza 3,3'-diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB; vedi figure 1 e 2). Ciò differisce dalla fluorescenza utilizzando un biotinilato orafano perossidasi (HRP) anticorpo secondario coniugato, che fornisce un enzima per convertire DAB ad un precipitato che è visibile al microscopio in campo chiaro. Nei casi in cui un unico antigene è di interesse o colorazione è tenuto ad essere di lunga durata, DAB può essere più adatto di colorazione fluorescente. Tuttavia, DAB colorazione non è molto adatto per la differenziazione tra più marcatori, soprattutto se due antigeni nucleari sono di interesse. Per informazioni sui materiali DAB e modifiche di protocollo, consultare Tabella 1. In alternativa, nitro blu tetrazolio cloruro / 5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (NBT / BCIP) può essere utilizzato per visualizzare una fosfatasi alcalina (AP) secondario coniugato anticorpo.

Figura 2:. Immagini rappresentative della DAB sezioni di tessuto cerebrale di ratto con etichetta singola nichel-enhanced cervello Rat sareZIONI che sono contrassegnati con DAB nichel-enhanced per Iba1 (A) e Pan-neuronale (B) consentire l'analisi di lunga durata della microglia o neuroni da soli. Bar Scala 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Si deve considerare l'abbondanza stimata dell'antigene di interesse all'interno del tessuto che viene analizzato. I metodi indiretti (come descritto sopra) sono utili per gli obiettivi a bassa abbondanza. Quando l'antigene di interesse è molto abbondante, metodi diretti possono essere applicati. Metodi diretti implicano un anticorpo primario che è direttamente coniugato ad un segnale di visualizzazione, e quindi non è richiesta anticorpo secondario. Questo metodo semplifica il processo di colorazione, ma elimina l'amplificazione ottenuti con metodi indiretti. Utilizzando un anticorpo primario direttamente coniugato elimina anche cross-reattività di anticorpi secondariquando doppia etichettatura.

Dettagli La presente comunicazione il protocollo per la doppia etichettatura con Iba1 e Pan-neuronali (dettagli nella tabella 1). Iba1 macchie microglia in molti stati di attivazione, tra cui ramificato, iper-ramificato, attivato, ameboidi, e l'asta. Macchie Pan-neuronali neuronale assoni, dendriti, e soma. Poiché Iba1 macchie più microglia e obiettivi Pan-neuronali del neurone, questa combinazione di macchie è utile ad acquisire una vasta comprensione delle interazioni microglia-neuroni.

In sintesi, immunoistochimica si basa sulla selezione accurata degli anticorpi. Poiché la domanda di ricerca diventa più specifica, anticorpi diretti contro antigeni alternativi possono desiderare. Per individuare un particolare stato di attivazione della microglia, si può scegliere di utilizzare anticorpi CD45 o CD68, piuttosto che Iba1. Inoltre, in collaborazione con i topi, F4 / 80 può fornire i risultati necessari. Allo stesso modo, gli elementi neuronali possono essere specificamente mirati con anticorpi razato contro il nucleo, sinapsi (pre o post), assone, e cono di crescita. Inoltre, ci sono altri indicatori che differenziano l'età del neurone (Double-Cortin, NeuN) e rigenerazione neuronale (GAP-43).