Primer voor Immunohistochemie op Cryosectioned Rat Brain Tissue: Voorbeeld kleuring voor Microglia en Neuronen

Immunohistochemie is een werkwijze voor het detecteren van antigenen (bijvoorbeeld eiwitten) in weefselsecties met primaire antilichamen die specifiek binden aan de antigenen van interesse. Immunohistochemie werd ontwikkeld door JR Marrack in 1934, toen hij bepaald dat antilichamen antigenen met grote specificiteit ¹ kon lokaliseren. Beginnend in 1942, enkele eerste in vitro studies met fluorescerende antilichamen tegen immunohistochemie visualiseren gepubliceerd ^2,3, waarna de eerste in vivo histochemische studie werd gepubliceerd ^4. Gedurende de 1960's, dertig jaar na de start van immunohistochemische werkwijzen, begon enzym-geconjugeerde antilichamen voor gebruik als secundaire reagentia. Deze methoden werden gelijktijdig en onafhankelijk van elkaar ontwikkeld in Frankrijk en de VS ^5,6. Vandaag de dag, een breed scala van antilichamen biedt eindeloze mogelijkheden voor immunohistochemie studies ^7.

"> De algemene doelstelling van deze correspondentie is om een ​​korte introductie in immunohistochemische kleuring zorgen, het is niet bedoeld om een ​​uitgebreid en uitputtend overzicht van deze techniek in de geschetste methode worden immunohistochemische technieken voor twee antigenen gepresenteerd (markers voor microglia en. neuronen) voor kleuring paraformaldehyd geperfundeerde, sucrose cryobeschermd, cryosectioned rattenhersenen. Immunohistochemische kleuring begint blokkeermiddelen-specifieke antigeenbinding aan achtergrondkleuring te verminderen. Vervolgens incubatie met primair antilichaam zorgt voor binding aan een specifiek antigeen in het weefsel. Na het primaire antilichaam, een ander antilichaam, genaamd secundaire antilichaam wordt aan het primaire antilichaam te koppelen aan een geconjugeerd visualisatie signaal ^8. Het tweede antilichaam is gericht op de immunoglobuline G (IgG) domein specifiek voor de diersoorten waarin de eerste antistof opgewekt werd. Het tweede antilichaam versterkt het signaal van het primaire antilichaam, aangezien de Fab-regio van tHij secundair antilichaam binden aan meerdere plaatsen op het IgG gebied van het primaire antilichaam. Enzymen of fluorescente moleculen geconjugeerd met de _Fc-regio van het secundaire antilichaam mogelijk visualisatie. Bijvoorbeeld, een konijn anti-Iba1 primair antilichaam een ​​konijn IgG-molecuul specifiek voor Iba1. Wanneer ezel anti-konijn IgG gebruikt als een secundair antilichaam, zal herkennen en binden aan meerdere gebieden van het konijn anti-Iba1 IgG (zie figuur 1). De ezel antilichaam kan worden gevisualiseerd door verschillende werkwijzen. Deze overeenstemming is gericht op de detectie van een fluorofoor geconjugeerd aan het tweede antilichaam, waarbij het primaire antilichaam herkent, voor visualisatie door fluorescentiemicroscopie. In fluorescerende immunohistochemie kan een nucleaire kleuring zoals Hoechst en DAPI worden gebruikt om alle kernen te visualiseren.

Figuur 1: SchEmatic representatie direct- en indirect antilichaam labeling technieken. Antilichamen binden aan het antigeen van belang en kan worden geamplificeerd door secundaire antilichamen opgewekt tegen de species van het primaire antilichamen. Deze techniek kan worden uitgevoerd met avidine-biotine complex (ABC) voor amplificatie en DAB visualisatie (A), of direct fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam (B). Als alternatief kunnen primaire antilichamen direct worden geconjugeerd met veel verschillende labels, waaronder biotine of een fluorofoor (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een alternatieve werkwijze voor het zichtbaar maken van immunohistochemische kleuring gebruikt 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB; zie figuren 1 en 2). Dit verschilt van fluorescentie met behulp van een gebiotinyleerd ofhorse-radish peroxidase (HRP) geconjugeerd secundair antilichaam, dat een enzym DAB zetten naar een precipitaat dat zichtbaar is onder helderveld microscopie levert. In gevallen waarin een enkele antigeen is van belang of kleuring is verplicht langdurig te zijn, kan DAB beter geschikt zijn dan fluorescerende vlekken zijn. Echter, DAB-kleuring is niet goed geschikt voor differentiatie tussen meerdere markers, met name als twee nucleaire antigenen van belang. Voor informatie over DAB materialen en protocol modificaties raadplegen Tabel 1. Anders, nitro blauw tetrazolium chloride / 5-broom-4-chloor-3-indolylfosfaat (NBT / BCIP) kan worden gebruikt om een alkalische fosfatase (AP) geconjugeerd secundair visualiseren antilichaam.

Figuur 2:. Vertegenwoordiger beelden van nikkel verbeterde DAB single-gelabeld rat hersenweefsel secties Rat hersenen seCTIES die zijn gelabeld met nikkel verbeterde DAB voor Iba1 (A) en Pan-neuronale (B) zorgen voor langdurige analyse van microglia of neuronen alleen. Schaalbalk 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Men moet rekening houden met de geraamde omvang van het antigeen van belang in het weefsel dat wordt onderzocht. Indirecte werkwijzen (zoals hierboven beschreven) zijn nuttig voor doelen met lage abundantie. Wanneer het antigeen van interesse is in hoge overvloed, kan directe methoden worden toegepast. Direct werkwijzen omvatten een primair antilichaam dat rechtstreeks is geconjugeerd aan een visualisatie signaal en dus geen secundair antilichaam nodig. Deze werkwijze vereenvoudigt het kleurproces, maar elimineert de versterking bereikt met indirecte methoden. Met behulp van een direct geconjugeerd primair antilichaam elimineert ook cross-reactiviteit van secundaire antilichamenals dubbel-labeling.

Deze mededeling beschrijft de protocol voor double-labeling met Iba1 en Pan-neuronale (details in tabel 1). Iba1 vlekken microglia in veel activering staten, waaronder vertakte, hyper-vertakte, geactiveerde, amoeboid en staaf. Pan-neuronale vlekken neuronale axonen, dendrieten, en soma. Aangezien Iba1 vlekken meest microglia en Pan-neuronale targets het neuron, deze combinatie van vlekken is nuttig bij het verkrijgen van een breed begrip van microglia-neuron interacties.

Kortom, immunohistochemische kleuring voert de zorgvuldige selectie van antilichamen. Aangezien de vraagstelling wordt specifieker kunnen antilichamen opgewekt alternatieve antigenen wensen. Om een ​​specifieke microgliale activeringstoestand richten, kan men kiezen om CD45 of CD68 antilichamen, in plaats van Iba1. Verder, in samenwerking met muizen, F4 / 80 kan de benodigde resultaten. Op dezelfde manier kan neuronale elementen specifiek worden gericht met antilichamen raseerde tegen de kern, synaps (pre- of post-), ​​axon, en de groei kegel. Daarnaast zijn er andere merkers die de leeftijd van het neuron (Double-Cortin, NeuN) differentiëren en neuronale regeneratie (GAP-43).