Doğru Algılama Fare B Lineage Hücreleri IgE-ifade
Summary
In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.
Abstract
B lenfosit immünoglobulin ağır zinciri (IgH) sınıf anahtarı rekombinasyon (CSR) ilk olarak, IgM IgA, IgE ve IgG olarak diğer IgH izotiplerinden geçer ifade edildiği bir süreçtir. In vitro IgH CSR ölçümü, moleküler ve hücresel immünoloji yönlerine DNA yeniden birleştirmesinden ve onarım kadar biyolojik süreçlerin bir dizi çalışma için bir temel yöntem. In vitro CSR deney aktive B hücreleri üzerindeki akış sitometrik ölçüm yüzey Ig ifade içerir. IgA ve IgG alt sınıflarının ölçümü kolay olmakla birlikte, bu yöntemle IgE ölçümü, çözünür IgE FcεRII bağlanma nedeniyle sorunludur / CD23 aktive B hücrelerinin yüzeyi üzerinde ifade edilmiştir. Burada kültür CSR geçirmiş fare B hücreleri, IgE üreten doğru bir şekilde ölçülmesi için benzersiz bir işlem tarif eder. yöntem cy ile sağlanan B tipi hücrelerin IgE üreten tespiti için izin hücre yüzeyleri üzerindeki IgE-CD23 komplekslerinin tripsin-sebepli bölünme dayanırtoplasmic lekelenmesi. Bu prosedür IgE KSS akış sitometri analizi için uygun bir çözüm sunuyor.
Introduction
Fare ve insan immünoglobulin ağır zinciri (IgH) sınıf anahtarı rekombinasyon (CSR) sırasında, IgH, sabit bölge ekzon (Cμ) silindi ve aşağı doğru sabit bölge eksonların çeşitli kümelerinin bir (Cı lH ler) (örneğin, Cγ değiştirilir μ Ig sınıflarına (örneğin, IgG, IgE ya da IgA) üretimine IgM üretimi ile ilgili bir anahtar elde Cε ve Ca'sına). CSR CH s, 1 her bir grubu için 5 'bölgesinde yer 1-10 kb sekansları anahtarı (s) bölgeleri içinde gerçekleşir. Aktivasyon Bağlı Sıtıdın Deaminaz (AID) enzim sitidinin deaminasyon etkinliği yoluyla CSR başlatır.
IgE allerjik hastalık 2 anahtar arabulucu ve IgE üretilen ve atopik hastalığı için yeni tedavi yaklaşımları kapılarını açabilir düzenlenir nasıl büyük bir anlayıştır. Farelerde ve insanlarda olarak IgE, en sıkı bir şekilde düzenlenmiş Ig izotiptir. IgE normal tim düzeyleri binlerce tespit edilires diğer IgH daha az 3 isotypes, ama çok hastalık durumlarında 4 yükselmiş olabilir. Bununla birlikte, IgE CSR tam olarak anlaşılamamıştır. B hücrelerinin in vitro aktivasyonu, IL-4, anti-CD40 veya LPS ile kombinasyon halinde her iki IgG1 ve IgE 5 CSR indükler kullanılmıştır. Aktive B hücreleri çözünebilir IgE CSR sonra kültür salgılanan bağlayan düşük afiniteli IgE reseptörü FcεRII / CD23 2,6, ifade eder. Akış sitometrisi ile analiz, bu nedenle, reseptör bağlı IgE lekesi ile B hücreleri benzer endojen IgE 7 sentezleyen B hücreleri için. O fare B biliniyor olsa da hücreler IgG1 sınıf anahtarlama ölçümü ile müdahale görünmüyor deneyimlerimiz düşük afinite IgG reseptörü FcγRIIB1 (CD32) 8, ifade eder. Kültür içinde, B hücresi aktivasyonu sonrası IgE geçiş ölçüm Ancak, spesifik olmayan yüzeyine bağlı IgE analizi gizleyebilir. Yaygın boyama yöntemleriyle olmayan IgE ifade eden hücreler IgE için pozitif leke.
Burada özetlenen fareler 9 arası gerçek IgE ifade B hücreleri KSS tahlilleri yapmak ve tespit etmek için kullanılmıştır bir stratejidir – 11. Tripsin ile aktive B hücrelerinin tedavisi, ortak bir laboratuar reaktif protein sindirimi, cytophylic ve membran hem de bağlı yüzey Ig kaldırır. Sitoplazmik IgE için sonraki permeabilization ve boyama, böylece gerçek IgE üreten hücreleri ortaya koymaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anti-CD40 ve IL-4 ile kültürde fare dalak B hücreleri uyarımı IgG1 ve IgE 5, T yardımcı tip 2 (Th2) etkileşimi teşvik edici sınıf değiştirme simule eder. B hücreleri, toplam splenositler 12 ya da saflaştırılmış ve splenik B hücrelerinin 11 bağlamında CSR etkinleştirilebilir. Protokol (adım 2.3) de belirtildiği gibi, B hücresi zenginleştirme isteğe bağlıdır, ve yararlı olurdu olmadığını belirlemek için deneyci takdirine bağlıdır. CD45R (B…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DRW NIH hibe AI089972 ve AI113217 tarafından ve Mukozal İmmünoloji Çalışmaları Ekibi tarafından desteklenen ve Burroughs Wellcome Fonu Tıbbi Bilimciler için Kariyer Ödülü tutar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10X) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10X) | Sigma Aldrich | T4174-100mL | 5.0g Trypsin, 2.0g EDTAŸ4Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | 10,000U Penicillin; 10 mg/mL Streptomycin (100X) |
| L-Glutamine 200mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100mL | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1X MEM-NEAA, 2.0mM L-glutamine, 1X Penicillin-Streptomycin (Penicillin:100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/mL), and anti-CD40 (1 µg/mL) |
References
- Chaudhuri, J., et al. Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism. Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).
- Gould, H. J., Sutton, B. J. IgE in allergy and asthma today. Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).
- Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. . Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).
- Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. Primary immune deficiencies with aberrant IgE production. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).
- Bacharier, L. B., Geha, R. S. Molecular mechanisms of IgE regulation. The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).
- Yokota, A., et al. Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression. Cell. 55 (4), 611-618 (1988).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).
- Callen, E., et al. 53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions. Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).
- Wesemann, D. R., et al. Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).
- Wesemann, D., et al. Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination. The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).
- Zarrin, A. A., et al. An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination. Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).
- Fan, G., et al. Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk. Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).
- Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, 67-94 (2004).
- Jamur, M., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).
- Ishizaka, T., Ishizaka, K. Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH. Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).
- Erazo, A., et al. Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo. Immunity. 26, 191-203 (2007).
- Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies. Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).
- Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition. Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).
- Berkowska, M. A., et al. Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways. The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).
- He, J. -. S., et al. The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response. The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).
- Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI. Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).
