Détection de True IgE exprimant Souris B cellules de la lignée
Summary
In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.
Abstract
B lymphocyte chaîne lourde d'immunoglobuline (IgH) recombinaison de commutation de classe (RSE) est un procédé dans lequel initialement exprimé IgM passe à d'autres isotypes IgH, comme IgA, IgE et d'IgG. Mesure de IgH RSE in vitro est une méthode clé pour l'étude d'un certain nombre de processus biologiques allant de recombinaison de l'ADN et de réparation à des aspects de l'immunologie moléculaire et cellulaire. Dosage in vitro RSE implique la cytométrie de flux surface de mesure expression Ig sur les cellules B activées. Bien que la mesure de sous-classes d'IgA et IgG est simple, la mesure des IgE par ce procédé est problématique en raison de la liaison des IgE à FceRII soluble / CD23 exprimé sur la surface de cellules B activées. Nous décrivons ici un procédé unique pour la mesure précise de cellules productrices d'IgE-B de souris qui ont subi RSE en culture. La méthode est basée sur le clivage de la trypsine à médiation de complexes IgE-CD23 sur la surface des cellules, ce qui permet la détection de l'IgE-production de cellules de la lignée B par cytoplasmic coloration. Cette procédure offre une solution pratique pour l'analyse par cytométrie en flux de la RSE à l'IgE.
Introduction
Au cours de chaîne lourde d'immunoglobuline (IgH) recombinaison de commutation de classe (RSE) chez les souris et les humains, l'IgH μ exons de région constante (Cp) sont supprimés et remplacés par un ou plusieurs ensembles de aval exons de région constante (C H s) (par exemple, Cy, Cε, et Ca), résultant en un passage de la production de IgM à la production d'autres classes d'Ig (par exemple IgG, IgE, IgA ou). RSE se produit au sein de commutateur (S), régions qui sont de 1 à 10 kb séquences situées en 5 'de chaque ensemble de C H 1 s. L'enzyme activation induite cytidine désaminase (AID) lance la RSE par l'activité cytidine désamination.
IgE est un médiateur clé de la maladie allergique 2 et une meilleure compréhension de la façon dont IgE est produit et réglementé peut ouvrir des portes à de nouvelles approches thérapeutiques pour la maladie atopique. Chez les souris et les humains, IgE est l'isotype Ig plus strictement réglementée. IgE est normalement détecté à des niveaux milliers de times moins que les autres IgH ISOTYPES 3, mais peut être très élevé dans quatre états pathologiques. Toutefois, la RSE à l'IgE ne est pas complètement comprise. In vitro l'activation des cellules B à l'aide d'IL-4 en combinaison avec l'anti-CD40 ou LPS, induit à la fois à la RSE IgG1 et IgE 5. Cellules B activées expriment le récepteur de faible affinité IgE FceRII / CD23 2,6, qui se lie IgE soluble sécrétée dans la culture après la RSE. Par conséquent, lorsque l'analyse de cytométrie en flux, les cellules B avec récepteur IgE liée tache similaire à B cellules exprimant de manière endogène IgE 7. Se il est connu que la souris B cellules expriment le récepteur de faible affinité IgG FcγRIIB1 (CD32) 8, dans notre expérience, il ne semble pas interférer avec la mesure de la commutation de classe d'IgG1. Cependant, lors de la mesure IgE commutation après l'activation des cellules B dans la culture, non spécifique lié à la surface IgE peut obscurcir l'analyse. Avec les méthodes de coloration communes, les cellules non-IgE exprimant colorent positivement pour les IgE.
Décrite ici est une stratégie qui a été utilisée pour mener des essais en matière de RSE et de détecter les véritables cellules IgE exprimant B de souris 9-11. Le traitement des cellules B activées avec de la trypsine, un réactif de laboratoire commun pour digérer les protéines, supprime surface à la fois lié à la membrane cytophylic et IgE. Après perméabilisation et une coloration cytoplasmique pour IgE révèle ainsi les véritables cellules productrices d'IgE.
Protocol
Representative Results
Discussion
La stimulation de la rate de souris les cellules B dans la culture avec anti-CD40 et IL-4 simule T auxiliaires de type 2 (T H 2) les interactions, la commutation de classe IgG1 et encourageant de 5 IgE. cellules B peuvent être activés pour la RSE dans le contexte de splénocytes un total de 12 ou de cellules B spléniques purifiées comme 11. Comme indiqué dans le protocole (étape 2.3), l'enrichissement des cellules B est facultative, et est à la discrétion de l'…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DRW est financé par des subventions du NIH AI089972 et AI113217, et par les études Immunologie équipe muqueuses, et titulaire d'une bourse de carrière pour les scientifiques médicaux du Burroughs Wellcome Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10X) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10X) | Sigma Aldrich | T4174-100mL | 5.0g Trypsin, 2.0g EDTAŸ4Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | 10,000U Penicillin; 10 mg/mL Streptomycin (100X) |
| L-Glutamine 200mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100mL | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1X MEM-NEAA, 2.0mM L-glutamine, 1X Penicillin-Streptomycin (Penicillin:100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/mL), and anti-CD40 (1 µg/mL) |
References
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