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High Throughput caracterização de células-tronco adultas modificadas para liberação de fatores terapêuticos como estratégia de neuroproteção

Published: January 04, 2015
doi:
10.3791/52242
, , , , , ,
1Department of Chemical and Biological Engineering,Iowa State University, 2Department of Genetics, Development and Cell Biology,Iowa State University, 3Biology Program,Iowa State University

Summary

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Abstract

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP).

Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed.

Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.

Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates.

This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Introduction

Um grande problema com a aplicação terapias úteis para o tratamento de distúrbios do sistema nervoso é no desenvolvimento de métodos eficazes que impedem uma maior degeneração e também facilitar a recuperação da função. Uma estratégia inovadora é geneticamente células-tronco engenheiro ex vivo, para a produção de fatores neuroprotetores, antes da sua transplante. Esta combinação de terapia com base em células, acoplada com um tipo de terapia genética, fornece um método poderoso para o tratamento de doença ou morte neuronal induzida por lesão no sistema nervoso.

Os factores neurotróficos são essenciais para o crescimento e sobrevivência de neurónios em desenvolvimento, bem como manutenção e plasticidade de neurónios maduros. Um certo número de estudos demonstraram um papel significativo de factores neurotróficos na promoção do crescimento inicial e diferenciação de neurónios no sistema nervoso central e periférico (SNP e do SNC) e também pode estimular a regeneração in vitro e numanimal modelos de lesão neural 1. O factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) é altamente expresso no sistema nervoso central e desempenha um papel importante na regulação do desenvolvimento neuronal, plasticidade sináptica e reparação 2. -Linha derivada de células da glia factor neurotrófico (GDNF) promove a sobrevivência de muitos tipos de neurónios, incluindo neurónios motores dopaminérgicos e 3. Assim, uma estratégia importante para a reparação neural é o de proporcionar fontes exógenas de factores neurotróficos para as regiões lesionados ou doentes do sistema nervoso.

As células estaminais mesenquimais derivadas da medula óssea multipotentes (MSCs) possuem um grande potencial para a administração de proteínas terapêuticas para tratar o sistema nervoso danificado ou doente. Transplante de MSCs atraiu considerável atenção nos esforços para desenvolver terapias baseadas em células compatíveis paciente uma vez que têm uma série de vantagens, incluindo, 1) relativa facilidade de obtenção e manutenção, 2) capacidade multipotencial, 3) preocupações éticas pouco, 4) Capacidade de sobreviver e migrar após o transplante e 5) potencial para o transplante autólogo 4,5. Resultados promissores foram relatados com o uso de MSCs ingênuos e geneticamente modificadas em modelos animais para um número de diferentes condições neurodegenerativas, incluindo a lesão da medula espinhal 6,7, acidente vascular cerebral 8,9, a deficiência de mielina 10, e degeneração da retina 11-13. Acoplamento transplante de células com a entrega de fatores neurotróficos a partir de células-tronco geneticamente modificadas é um romance e importante estratégia de reparo neural.

Um passo essencial no desenvolvimento de sistemas de libertação terapêuticos de factor de base celular é determinar a saúde normal das células modificadas. Como tal, o principal objetivo deste estudo foi avaliar os parâmetros de crescimento gerais de células-tronco adultas geneticamente modificadas. Uma abordagem importante para uma avaliação rápida de vários parâmetros celulares é empregar celular de alta através de triagens com base em imagensg (HTS), muitas vezes referido rastreio conteúdo tão alto (HCS) procedimentos 14. Esta tecnologia permite a aquisição e análise de imagem automatizado, e esta abordagem é particularmente bem adaptado para aplicações de investigação de células estaminais. Neste projeto foi desenvolvida uma plataforma de criação de perfil que permite a rápida caracterização e otimização das preferências substrato celular e funções celulares com células-tronco adultas geneticamente modificadas empregando um sistema de HCS.

Protocol

1. Preparação do Substrato para placas de 96 poços Criar um mapa da placa de 96 poços descrevendo os diferentes substratos e tipos de células a ser examinada (Figura 1). Obter as soluções estoque de diferentes substratos [poli-L-lisina, fibronectina, colagénio do tipo I, laminina e colagénio IV-entactina-laminina (ECL)], uma placa de 96 cavidades com múltiplas cavidades e preparar uma estação de trabalho em uma cultura de células estéril capô. Prepare substratos individuais por diluição em estoque estéril salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração final de 5 ug / ml (esta concentração foi previamente determinada baseada num ensaio dependente da concentração do substrato para o crescimento e proliferação de células). Misture usando um vortex antes de verter para um reservatório estéril. Adicionar 100 ul de solução de substrato a cada poço de acordo com o mapa de 96 poços (Figura 1) (uma micropipeta de 12 ou 8 canais é conveniente para micropipetting em uma placa de 96 poços). Selar a tampa para a placa de 96 poços, utilizando uma tira de Parafilm e armazenar durante a noite a 4 ° C. 2. celular Galvanização e tempo-lapso NOTA: Rato MSCs foram isoladas a partir da medula óssea de adultos C57BL / 6 e mantidas como uma linha de células aderentes. MSCs foram infectadas utilizando vectores lentivirais para engenheiro-los para secretar derivado do cérebro do factor neurotrófico (BDNF; cDNA humano) e glial factor neurotrófico derivado de células (GDNF; cDNA humano) utilizando de um vector lentiviral que codifica o BDNF (LV-BDNF; CMV-BDNF-IRES -GFP), GDNF (LV-GDNF, GDNF-CMV-IRES-GFP), proteína fluorescente e verde (GFP, LV-GFP; CMV-GFP). NOTA: Os meios de cultura para as células-tronco do rato mesenquimais (MSCs) é modificado meio de Iscove da Dulbecco contendo 10% de soro de hibridoma qualificado fetal bovino, 10% de soro equino, 2 mM de L-glutamina, e 10.000 U / ml de penicilina, 10 mg / ml de estreptomicina . Os cinco tipos diferentes de MSCs mouse (MSCs, GFP-MSCs, BDNF-GFP-MSCs, GDNF-GFP-MSCs e BDNF / GDNF-GFP-MSC) foram plaqueadas a cerca de 30% de confluência em frascos T75 de cultura de células. Celular Galvanização No dia seguinte, as soluções de substrato remover por aspiração e lavar cada cavidade com cerca de 200 ul de PBS estéril, duas vezes. Adicionar meio de cultura celular (200 ul / poço) a cada poço, após o enxaguamento final de PBS. Colocar a placa de 96 poços numa incubadora de cultura de células definido a 37 ° C e 5% de CO 2 por razões de equilíbrio. Embora a placa de 96 poços é equilibrar na incubadora, a colheita das células (MSCs em frascos T75 deve ser de aproximadamente 70% confluentes no momento da colheita / metalização), recolhendo o meio de crescimento (como a que se refere aos meios condicionados) do frasco T75 e armazenar num tubo de 15 ml, sob condições estéreis (este meio condicionado será utilizado no passo 2.1.4). Adicionar 8 mL de PBS estéril para o frasco e agitar suavemente e, em seguida, para fora da pipeta PBS e adicionar 1 ml de tripsina a 0,05% e 0,01%Solução de EDTA para desprender as células da superfície do frasco de cultura T75. Monitor de separação celular, exibindo o balão utilizando um microscópio invertido equipado com óptica de contraste de fase. Quando as células têm destacado, imediatamente adicionar 8 ml de meio condicionado (coletados na etapa 2.1.2) para o balão. Recolha a suspensão de células e transferir para um tubo de 15 ml de centrífuga cónico e centrifugar durante 4 minutos a 450 xg para sedimentar as células. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 200 ul de fresco e aquecida (37 ° C), meios de cultura celular. Determinar o número de células na suspensão de células através da realização de uma contagem de células viáveis ​​azul de tripano utilizando um hemocitómetro. Placa as células a uma densidade de aproximadamente 300 células / poço em poços apropriados da placa de 96 poços. Repita essas etapas para cada população de células. Time-lapse imagem Depois de todos os MSCs foram banhados, lugara placa de 96 poços em uma incubadora durante 2 horas para permitir que as MSCs para anexar o substrato. Inicie o sistema HCS e esperar por 2 horas para o sistema atinja o equilíbrio. Definir o controlador ambiental a 37 ° C e ligar-se um cilindro de gás misturado contendo 5% de CO 2 em ar para o sistema de câmara ambiental HCS fornecimento de uma fonte de ar constante. Remova a placa de 96 poços da incubadora a seguir ao período de equilíbrio de 2 horas e colocar directamente para a câmara de crescimento de células do sistema de HCS. Permitir 30 min para o equilíbrio para explicar qualquer expansão relacionada com o calor da placa e, em seguida, começar a aquisição e análise de imagem do software para configurar as definições de placa. Selecione o objetivo 20X para a imagem latente. Selecione dois poços por condição [ie, GFP-MSCs em Fibronectin etc. (6 substratos x 5 subtipos MSC para um total de 30 condições x 2 repetições = 60 poços no total)] para a criação de imagens de lapso de tempo. Escolha dois locais para a imagem latente comem cada poço. Escolha os comprimentos de onda de luz corretos para criação de imagens. NOTA: Dois comprimentos de onda diferentes (contraste de fase e fluorescência da GFP) foram selecionados para geração de imagens de lapso de tempo. Concentre-se no bem inferior utilizando a focagem automática a laser e tomar imagens de teste para vários sites e vários poços para encontrar um plano focal otimizado. Uma vez que o foco tenha sido estabelecido, iniciar a captura de imagens a cada 5 minutos durante 48 horas para todos os 60 poços (120 sites). Alimentar as células a cada 24 h, removendo a placa de 96 poços a partir do sistema de HCS. Retirar 75 ul de meio de cada poço e adicionar 100 uL de meio fresco a cada poço (equilibrar este meio fresco a 37 ° C e 5% de CO 2). No final da experiência de lapso de tempo, remover a placa de 96 poços a partir do sistema de HCS. Sob condições estéreis, recolher as amostras de meio condicionado de cada poço e transferir estas amostras para outra placa de 96 poços. NOTA: As amostras podem ser utilizadas para outras analysé através da realização de ELISA para os factores neurotróficos. Preparar a placa de 96 poços com MSCs cultivadas para ensaios adicionais, tais como ensaio de proliferação celular Ki67 ou iodeto de propídio ensaio de coloração vivo / morto (ver detalhes abaixo). Realizar análise de imagens de lapso de tempo para a célula de acompanhamento da migração / célula, conforme descrito no item 5 abaixo. 3. Ki67 proliferação celular e iodeto de propídio Vivo / Dead Assay Ensaio de proliferação celular Ki67 (imunocitoquímica) Lavar as culturas de células com 0,1 M de fosfato (PO 4) tampão durante um minuto duas vezes. Fixar a cultura com 4% de paraformaldeído (PFA) durante 20 min à temperatura ambiente. Retire a PFA e lavar os poços com PBS durante sete minutos, três vezes. Após a lavagem final, adicionar 100 ul de solução bloqueador (solução salina de tampão fosfato, 5% de soro de burro normal, 0,4% de albumina sérica bovina e 0,2% de Triton X-100) a cada poço umand incubar à temperatura ambiente durante 1 h. Prepare o anticorpo primário, anticorpo de coelho anti-Ki67, por diluição em solução bloqueador numa razão de trabalho de 1: 200. Remover a solução de bloqueador e aplicar a 100 ul de solução de anticorpo primário em cada poço. Cobrir a placa de 96 poços e incuba-se as amostras a 4 ° C durante a noite. No dia seguinte, remover a solução de anticorpos e enxaguar com PBS durante 7 min, 3 vezes. Prepare o anticorpo secundário, de burro anti-coelho de Cy3 em solução de bloqueio a uma razão de trabalho de 1: 500. Adicionar corante nuclear DAPI para a solução de anticorpo secundário, a uma diluição de 1: 100. Após a remoção da última lavagem de PBS, aplicam-se 100 ul da solução de anticorpo / DAPI secundário para cada poço. Incubar à temperatura ambiente no escuro durante 90 min. Remover a solução de anticorpo secundário / DAPI e lavar cada poço com PBS durante 7 min, 3 vezes. Cobrir a placa de 96 poços e armazenar a 4 ° C até à imagiologia. Propidium Iodeto Vivo / Dead Assay Medir a morte celular por iodeto de propídio (PI) ensaio de exclusão, tal como descrito abaixo. Preparar a solução corante de iodeto de propídio, a uma concentração de 1,5 uM em meio de cultura. Adicionar 100 ul de etanol a 70% para um poço de MSCs durante 2 minutos com o objectivo de matar essas células. Este poço serve como um controlo positivo para a mancha PI. A maioria dos MSC será indicando morte celular corada-PI. Remover a solução de etanol. Adicionar 100 ul de solução corante de iodeto de propídio a cada poço e incubar durante 20 min a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2. Lavar as células com tampão de fosfato 0,1 M durante 1 minuto, duas vezes. Fixar as células com PFA a 4% em tampão H P0 4 a 0,1 durante 20 minutos à temperatura ambiente. Retire a PFA e enxaguar com PBS três vezes por 7 min. Incubar com solução DAPI (1:50) diluído em solução bloqueador durante 1 hora à temperatura ambiente. Lave todos os poços comPBS durante 7 min, 3 vezes. Remover a solução de DAPI e lavar cada poço com PBS durante 7 min, 3 vezes. Cobrir a placa de 96 poços e armazenar a 4 ° C até à imagiologia. Análise 4. Automated Imaging and Multiwavelength Scoring Carregar uma placa de 96 poços (anteriormente transformadas por imunomarcação de Ki67 ou iodeto de propídio manchado de) no sistema HCS e permitem que a placa equilibrar durante 20 min Abra aquisição e análise de imagem do software do sistema HCS. Escolha as configurações de aquisição para a objetiva de 10X usando câmera binning a 1 e um ajuste de ganho de 2. Encontre o Z-plano, no qual as células residem, utilizando a função Auto Exposição e calcular o deslocamento para cada comprimento de onda de interesse. Para esta análise, capturar imagens para DAPI (W1), Cy3 (W2) e FITC (W3). Escolha o nível de intensidade máxima em que os poços de controlo negativo não mostram nenhum sinal de aquisição de imagem. Confirme esta configuração é adequada para o pospoços tivo. Adquirir placa. Capturar imagens e armazená-los na aquisição de imagem e de banco de dados do software de análise. Uma vez que as imagens tenham sido adquiridos, imagem aberta aquisição e análise de software off-line e avaliação de placas de dados a partir das imagens adquiridas anteriormente. Selecione a análise de pontuação Multi-comprimento de onda. Configure o intensidades mínimas e máximas para cada comprimento de onda. Nota: A detecção DAPI deve marcar a coloração ao redor de cada núcleo visível. Cy3 deve detectar as células positivas com Ki67 imunoreactividade (IR) e não deve detectar IR sob os controlos negativos. Para Cy3 Ki67 IR, a largura mínima aproximada foi de 7 mm, largura máxima aproximada foi de 30 mm, a intensidade acima do fundo local, foi de 150 níveis de cinza, e área manchada a mínima foi de 50 mm 2. Executar análise para todas as posições. Exportar os dados para ver em planilha. Rastreamento 5. celular Abrir imagem acquisition e programa de análise e clique em "revisão placa de dados [DB] …", selecionando a placa de interesse. Veja os dados como "Time vs. Bem". Escolha um dos sites da seção "Sites" clicando com o botão esquerdo na seleção desejada. Selecione "Transmitido …" sob o título "Os comprimentos de onda:". Botão direito do mouse sobre o alvo bem no modelo de placa de 96 poços e clique em "Carregar imagens". Acompanhe as células, clicando sobre os "Aplicativos" e, em seguida, "Objetos faixa". Use "Dynamic Data Exchange (DDE)" para escolher o formato para exportar os dados, por exemplo, o Microsoft Excel. Escolha os dados de controle de exportação, por exemplo, o tempo decorrido, o número de objeto, a distância, intervalo de tempo, velocidade, ângulo absoluto, distância de origem, delta x e y delta. Marcar cada célula de interesse com "tecla Ctrl + clique esquerdo" nas células-alvo. Células Pista. Se necessário, parar / alterar rastreamento indevido de células com a tecla "Esc" e, em seguida, ajustar as configurações. Após rastreamento celular está completo, salvar os dados com "Log de dados".

Representative Results

Parâmetros de crescimento MSC foram examinados por cultura das diferentes populações de MSCs em diferentes substratos. Os cinco diferentes populações de subtipos de MSC (MSC GFP-MSCs, o BDNF-GFP-MSCs, o GDNF-GFP-MSC, e BDNF / GDNF-GFP-MSC) foram plaqueadas em placas de 96 poços de cultura de tecidos pré-revestidas com o diferente substratos como ilustrado na Figura 1. Após quatro dias de cultura, as placas foram fixadas e immunolabeled e / ou corada com os reagentes apropriados e, em seguida, examinadas usando o sistema de HCS e as análises efectuadas com o programa de aquisição de imagem e análise de software. Figura 1:. Molde placa de 96 poços para o design experimental placas de 96 poços foram revestidas com vários substratos e os poços foram semeadas com células estaminais Engineered como mostrado no modelo. Como um exemplo, apenas microcavidadels em linhas BF foram utilizados neste experimento. Linhas A, G e H foram deixados vazios. Abreviações – CTM: células-tronco mesenquimais; GFP-MSCs: verde fluorescente MSCs que expressam proteínas; BDNF-GFP-MSCs: derivado do cérebro factor de MSCs que expressam GFP-neurotróficos; GDNF-GFP-MSC; Glial derivada de células que expressam o factor de MSCs-GFP neurotróficos; BDNF / GDNF-GFP-MSC; BDNF e GDNF expressando GFP-MSC; ECL: entactina-Collagen IV-A laminina). Anti-Ki67 de imunomarcação, seguida por contrastação com DAPI, foi utilizada para avaliar se os diferentes substratos influenciado proliferação das diferentes populações de MSCs modificadas (Figura 2A). A expressão do antigénio Ki67 ocorre preferencialmente durante tardias G 1, S, G2 e M as fases do ciclo celular, e não é detectada em células em fase de repouso a 0 (G), e, por conseguinte, é útil como um marcador para a proliferação celular 15 . 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) é um nu utilizadacounterstain clara e cromossomo que emite fluorescência azul na ligação a AT regiões do DNA 16. O número total de células em um campo pode ser determinada pela contagem do número de núcleos corados com DAPI. Tal como ilustrado na Figura 2B, embora tenha havido variações nas percentagens de MSCs em proliferação, todos os substratos, no entanto, a proliferação celular considerável suportado por cada um dos subtipos de MSC. Figura 2: Ensaio de proliferação celular Ki67. (A) Mesclado, imagem double-fluorescente de Ki67 imunomarcação (vermelho) e DAPI (azul) de coloração nuclear. Muitas das MSCs foram immunolabeled com o anticorpo Ki67 (vermelho). Escala da barra = 50 m. (B) O gráfico de barras que ilustra as percentagens de Ki67 imunomarcadas subtipos MSC cultivadas em poliestireno (PS), poli-L-lisina (PLL), a fibronectina, o colagénioTipo I, laminina, ou entactina-colágeno IV-laminina (ECL) substratos durante 5 dias in vitro (DIV). N = um experimento. Cada barra representa uma média de dados obtidos a partir de 8 sites fotografada a partir de 2 poços para cada condição. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Iodeto de (PI) coloração de propidio foi utilizada para avaliar se substratos diferentes influenciada sobrevivência celular (Figura 3). O iodeto de propídio é um cromossoma nuclear e contracorante vermelho fluorescente vulgarmente utilizados. O iodeto de propídio é impermeante de membrana e geralmente excluídos das células viáveis ​​e, assim, é útil para detectar células mortas numa população. A proporção de células mortas dentro de uma dada condição pode ser determinada quando combinado com um marcador nuclear geral tal como DAPI para identificar todas as células dentro de um campo. A porcentagem de células PI-positivos foi baixa em todos os substratos analisados ​​(A Figura 3). Como um controlo positivo para o reagente de PI, alguns poços contendo as MSCs foram incubadas em 70% de etanol, uma condição conhecida para matar a maioria das células, o que resulta numa alta percentagem de células marcadas com PI como ilustrado na Figura 3B e 3C (etanol tratado positiva controlo). Figura 3: Ensaio de morte de células iodeto de propídio. (A) Mesclado, imagem fluorescente duplo para iodeto de propídio (vermelho) e DAPI (azul) de coloração. Embora os núcleos de todas as células viáveis ​​foram coradas com DAPI (azul), sem coloração com iodeto de propídio foi detectado no MSC. (B) Praticamente todas as MSCs foram coradas com iodeto de propídio a seguir a exposição a etanol a 70%. As barras de escala em A e B = 100 mm. (C) Gráfico de barras que ilustra as percentagens de iodeto de propídio (PI) corado subtipo MSCs cultivadas em poliestireno (PS), poli-L-lisina (PLL), a fibronectina, o colagénio do tipo I, laminina, colagénio ou entactina-IV-laminina (ECL) substratos, durante 5 dias in vitro (DIV). Controlo Etanol: Esta condição serviu como um controlo positivo para o reagente de coloração de PI. A maioria das células submetidas a PI mancha após o tratamento de etanol estão mortos e, assim, corou positivamente para o reagente PI. N = um experimento. Cada barra representa uma média de dados obtidos a partir de 8 sites fotografada a partir de 2 poços para cada condição. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Para investigar a possível influência de diferentes substratos sobre o comportamento de MSCs de engenharia, a migração celular foi analisada por microscopia digital de time-lapse e do sistema de câmara de luz transmitida / ambiental no sistema de HCS (ver Suplementar Video 1). Vários sites / poço foram time-lapse fotografadae utilizados para calcular as taxas de migração celular para os diferentes sub-populações de MSCs que crescem em diferentes substratos utilizando o programa de software de aquisição e análise de imagem. Em geral, conforme mostrado na Figura 4C, todos os subtipos de MSCs mostraram a taxa de migração mais rápida sobre as superfícies revestidas com matriz extracelular (fibronectina, colagénio, laminina e ECL) e o mais lento em superfícies de poliestireno não-revestidas. Figura 4:. Rastreamento celular e migração MSCs rastreados com aquisição de imagem e software de análise. Imagens Overlayed de transmissão de luz e imagens de fluorescência (A) o início da imagem time-lapse e (B) em 29 horas mais tarde, no final da sessão de imagem time-lapse (ver Suplementar Video 1). Faixas de migração celular estão indicadas pelo li cornes. Escala da barra: 50. Gráfico mm (C) de barras que ilustra as taxas de migração média (expressa como mm / h) para os subtipos de MSC cultivadas em poliestireno (PS), poli-L-lisina (PLL), a fibronectina, o colagénio tipo I, laminina, ou entactina-colágeno IV-laminina (ECL) substratos para 2 dias in vitro (DIV). N = um experimento. Cada barra representa a média de pelo menos 10 células fotografada a partir de 2 poços para cada condição. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Tomados em conjunto, estes resultados fornecem evidência preliminar de que estas subpopulações de MSCs modificadas geneticamente exibir propriedades de crescimento semelhantes. Estes resultados fornecem evidências convincentes de que o lentivírus mediada alterações genéticas dessas MSCs não induziu efeitos deletérios detectáveis ​​dramáticos sobre os parâmetros de crescimento investigados usando esta plataforma de triagem. <p class= "Jove_content"> Suplementar vídeo 1. Time-lapse de vídeo digital de rastreamento MSC utilizando o programa de software de aquisição e análise de imagem. O caminho de migração é para dois MSCs [indicados como 1 (linha de rastreamento verde) e 2 (linha de rastreamento azul)] são ilustrados. Vídeo capturado durante um período de 29 horas. As imagens foram capturadas a cada 5 minutos. Imagens de fluorescência de MSCs expressando GFP foi usado para geração de imagens de lapso de tempo na preparação do vídeo. Bar Calibração = 50 mm. Este tipo de análise é útil para investigar comportamentos de células, incluindo a migração celular e divisão celular.

Discussion

As células estaminais mesenquimais (MSCs) adultos são um tipo de célula atractivo para o desenvolvimento de uma estratégia experimental combinando uma terapia baseada administração celular e genética. MSCs são multipotentes, capazes de se diferenciar em células de linhagem mesodérmica, e exibir plasticidade considerável, diferenciação / transdifferentiating em linhagens neuronais e gliais com a indução apropriado paradigmas 17,18. Além disso, as MSC foram transplantados e provou ser eficaz em estudos pré-clínicos para um número de distúrbios, incluindo condições neurodegenerativas 19. A eficácia terapêutica do MSC é bem conhecida devido à sua benéfica anti-proliferativos, anti-inflamatórias e anti-apoptóticos actividades 20. MSCs também são conhecidos por produzir e secretar vários fatores neurotróficos e crescimento, o que provavelmente contribui para as qualidades neuroprotetoras associados com MSCs ingênuos após o transplante em locais de lesão ou doença 21. Importantly, as MSCs pode ser geneticamente modificada para a libertação prolongada de factores neurotróficos para aplicações de terapia génica baseada em celular e combinados e têm sido utilizados num certo número de modelos animais de lesão ou doença do SNC 11,19,22.

No desenvolvimento de uma estratégia baseada em terapia celular e de genes combinados, é importante que a saúde das células é verificada cuidadosamente antes da sua utilização in vitro extensiva, e especialmente em aplicações in vivo. Como prova de conceito, investigou várias populações de linhas de engenharia e controle MSC, a fim de estudar as consequências das modificações genéticas sobre a saúde celular e fitness usando uma abordagem de triagem alto teor (HCS). Em geral, refere-se a HCS celular high throughput screening com base em imagens 14. Esta abordagem de triagem permite uma avaliação quantitativa dos fenótipos celulares em múltiplos níveis de espacial (celulares para subcelular) e temporais (milésimos de segundo para dias) resolution em várias condições experimentais. Usando esta abordagem foi acessado possíveis diferenças de preferência substrato sobre os seguintes parâmetros: a proliferação, a expressão da proteína verde fluorescente (GFP), a morte celular, a mobilidade celular e / migração. As experiências foram concebidas em formato de 96 poços da placa de cultura de células. Dentro de uma única placa que são rotineiramente investigadas possíveis diferenças relacionadas com o substrato, com respeito a cada parâmetro para as diferentes populações de células MSC transduzidas com lentivírus e os MSCs modificadas em comparação com o original, MSC não transduzidas. Isto proporcionou um meio para comparar directamente os resultados para os diferentes subtipos de MSC com uma bateria de ensaios in vitro, tais como a proliferação de células utilizando imunomarcação de Ki67, ensaio de viabilidade de células vivas / mortas utilizando coloração com iodeto de propídio, e o comportamento das células através da realização de imagens digitais de lapso de tempo . Como uma extensão deste HCS também se pode realizar os testes ELISA em amostras de meio condicionado coletados de w indivíduoells para determinar quantitativamente a secreção de factores neurotróficos. O meio condicionado a partir de diferentes subtipos MSC pode também ser utilizado em bioensaios in vitro para determinar a actividade biológica de factores secretados 11,23. Este tipo de plataforma HCS também pode ser usado para as medições in vitro de crescimento de neurites a partir de culturas neuronais primárias e linhas de células estaminais neurais 24. Em geral, os nossos resultados demonstraram que as subpopulações das MSCs modificadas geneticamente apresentaram comportamento semelhante em comparação com as MSCs não modificados. A influência de diversos substratos de cultura no crescimento das células e a migração das células não foi significativamente diferente entre os subtipos de MSC, bem como substratos de cultura. Como tal, os substratos de matriz extracelular testados não parecem desempenhar um papel crítico na modulação destes aspectos do comportamento celular para estas MSCs Engineered diferentes.

Este estudo demonstra a utilização de um sistema de análise de HCS diferenaspectos t de comportamento celular. No entanto, não é raro encontrar limitações associadas com análise de imagem. Na ocasião, enquanto analisando as imagens de fluorescência, era um tanto difícil de determinar o valor limiar acima do qual correcta immunolabeled ou células coradas seria contado como positivamente marcado / manchado. Assim, para minimizar o viés subjectivo, a determinação dos limiares era dependente de uma comparação com controlos (controlos negativos para imagens de fluorescência foram realizadas em paralelo, durante todo o processamento pela omissão dos anticorpos primários ou secundários). Outra limitação foi encontrado durante a análise da migração de células usando imagens digitais de lapso de tempo-. Em alguns casos, o software de imagem não foi capaz de diferenciar entre o movimento Browniano aleatório de uma célula contra uma célula realmente fazer a migração apenas uma distância muito curta. Outras limitações foram evidentes em situações em que o software de análise não é capaz de distinguir a presença de multipcélulas Le em muito próximo de um outro. Para superar esta limitação necessária selecção manual de células durante a análise ao invés de uma análise totalmente automatizado. Densidade de plaqueamento celular também pode resultar em dados de inclinar a migração celular entre as populações de células que exibem uma maior preferência para crescer em aglomerados contra células que crescem de forma isolada umas das outras. Estes tipos de diferenças são em parte provavelmente um reflexo da célula-substrato contra preferências célula-célula.

Usando um sistema de HCS para adquirir imagens e executar análise de dados fornece um meio eficiente e rápido para avaliar vários parâmetros celulares. Além disso, o time-lapse de vídeos digitais para 30 condições diferentes (seis substratos e 5 subtipos MSC diferentes) foram rotineiramente adquirida por períodos que variam de horas a dias (48 horas) durante o uso da câmara ambiental. Estes dados foram posteriormente utilizadas para calcular e determinar as diferenças nas taxas de migração de células em várias linhas celulares em ECM diferentemoléculas.

Neste relatório, nós destacamos a implementação de uma plataforma de triagem de alto conteúdo para avaliar a saúde e função das células. Este tipo de análise é útil para o desenvolvimento de estratégias racionais para a concepção de tipos de células, bem como os substratos de polímero para facilitar o crescimento celular e a regeneração neural dirigida. Este é um passo essencial para a aplicação da entrega à base de células-tronco de fatores terapêuticos antes da extensa em estudos pré-clínicos in vivo utilizando estratégias de transplante de células.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Funding for this research was provided by the US Army Medical Research and Materiel Command (Grant account no. W81XWH-11-1-0700) and the Stem Cell Research Fund. PAB and EMP were recipients of Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).

Materials

96 well plates Greiner Bio One 655090 96 well plates selected for use in ImageXpress
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) A9647
Rabbit anti-Ki67 antibody Abcam (Cambridge, MA) Ab16667 1:200 dilution
Collagen type I Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) C7661 Collagen from rat tail
DAPI Invitrogen (Carlsbad, CA) D3571
Donkey anti-Rabbit Cy3 Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)  711-165-152 1:500 dilution
ECL(Entactin-Collagen-Laminin) Millipore/Chemicon (Temecula, CA) 08-110
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone (Logan, UT) SH30071.03
Equine serum Hyclone (Logan, UT) SH3007403
Ethanol Chemistry Store (Ames, IA) 12003510 100%, 200 proof
Fibronectin Fisher Scientific (Hampton, NH) CB-40008
Iscove’s Modified Dulbeccos Medium (IMDM) Hyclone (Logan, UT) SH30396.03
KH2PO4 Fisher Scientific (Hampton, NH) P285 For PO4 buffer
K2HPO4 Fisher Scientific (Hampton, NH) P288 For PO4 buffer
L-Glutamine Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY) 25030-081
Laminine (mouse) Trevigen (Gaithersburg, MD) 3400-010-01
Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA) Isolated from bone marrow
Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF) These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation)
Normal donkey serum (NDS) Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)  017-000-121
Paraformaldehyde (PFA) Fisher Scientific (Hampton, NH) O4042 4% PFA in 0.1M PO4 buffer
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) P0781
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) P4417
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) P4707
Propidium iodide (PI) Invitrogen (Carlsbad, CA) P1304MP
Triton X-100 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) X100
Trypsin 0.05% (EDTA 1X) Invitrogen (Carlsbad, CA) 25300-054
Iscove's Modified Dulbecco's Medium Invitrogen (Carlsbad, CA) 12440–046
Hybridoma-qualified FBS Hyclone (Logan, UT) SH30396.03
Equine serum Hyclone (Logan, UT) SH3007403
ImageXpress Micro Molecular devices (Sunnyvale, CA) ImageXpress micro High content screening system
MetaXpress 4.0 Molecular devices (Sunnyvale, CA) MetaXpress 4.0 Image acquisition and analysis software
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References

  1. Thoenen, H., Sendtner, M. Neurotrophins: from enthusiastic expectations through sobering experiences to rational therapeutic approaches. Nature neuroscience. 5 Suppl, 1046-1050 (2002).
  2. Park, H., Poo, M. M. Neurotrophin regulation of neural circuit development and function. Nature reviews. 14, 7-23 (2013).
  3. Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science (New York, N.Y.). 260, 1130-1132 (1993).
  4. Azizi, S. A., Stokes, D., Augelli, B. J., DiGirolamo, C., Prockop, D. J. Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats–similarities to astrocyte grafts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3908-3913 (1998).
  5. Prockop, D. J., Gregory, C. A., Spees, J. L. One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 Suppl 1, 11917-11923 (2003).
  6. Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells. Glia. 39, 229-236 (2002).
  7. Hofstetter, C. P., et al. Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 2199-2204 (2002).
  8. Chopp, M., Li, Y. Treatment of neural injury with marrow stromal cells. Lancet neurology. 1, 92-100 (2002).
  9. Li, L., et al. Transplantation of marrow stromal cells restores cerebral blood flow and reduces cerebral atrophy in rats with traumatic brain injury: in vivo MRI study. Journal of neurotrauma. 28, 535-545 (2011).
  10. Jin, H. K., Carter, J. E., Huntley, G. W., Schuchman, E. H. Intracerebral transplantation of mesenchymal stem cells into acid sphingomyelinase-deficient mice delays the onset of neurological abnormalities and extends their life span. The Journal of clinical investigation. 109, 1183-1191 (2002).
  11. Harper, M. M., et al. Transplantation of BDNF-secreting mesenchymal stem cells provides neuroprotection in chronically hypertensive rat eyes. Investigative ophthalmology & visual science. 52, 4506-4515 (2011).
  12. Arnhold, S., et al. Adenovirally transduced bone marrow stromal cells differentiate into pigment epithelial cells and induce rescue effects in RCS rats. Investigative ophthalmology & visual science. 47, 4121-4129 (2006).
  13. Inoue, Y., et al. Subretinal transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells delays retinal degeneration in the RCS rat model of retinal degeneration. Experimental eye research. 85, 234-241 (2007).
  14. Xia, X., Wong, S. T. Concise review: a high-content screening approach to stem cell research and drug discovery. Stem cells (Dayton, Ohio). 30, 1800-1807 (2012).
  15. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of cellular physiology. 182, 311-322 (2000).
  16. Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & histochemistry : official publication of the Biological Stain Commission. 70, 220-233 (1995).
  17. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 41-49 (2002).
  18. Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. Journal of Neuroscience Research. 61, 364-370 (2000).
  19. Huang, B., Tabata, Y., Gao, J. Q. Mesenchymal stem cells as therapeutic agents and potential targeted gene delivery vehicle for brain diseases. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 162, 464-473 (2012).
  20. Uccelli, A., Benvenuto, F., Laroni, A., Giunti, D. Neuroprotective features of mesenchymal stem cells. Best Pract Res Clin Haematol. 24, 59-64 (2011).
  21. Forostyak, S., Jendelova, P., Sykova, E. The role of mesenchymal stromal cells in spinal cord injury, regenerative medicine and possible clinical applications. Biochimie. 95, 2257-2270 (2013).
  22. Shi, D., et al. The effect of lentivirus-mediated TH and GDNF genetic engineering mesenchymal stem cells on Parkinson’s disease rat model. Neurological sciences : official journal of the Italian Neurological Society and of the Italian Society of Clinical Neurophysiology. 32, 41-51 (2011).
  23. Harper, M. M., et al. Brain-derived neurotrophic factor released from engineered mesenchymal stem cells attenuates glutamate- and hydrogen peroxide-mediated death of staurosporine-differentiated RGC-5 cells. Experimental eye research. 89, 538-548 (2009).
  24. Harrill, J. A., Freudenrich, T. M., Machacek, D. W., Stice, S. L., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in human embryonic stem cell-derived hN2 cells using automated high-content image analysis. Neurotoxicology. 31, 277-290 (2010).

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Sharma, A. D., Brodskiy, P. A., Petersen, E. M., Dagdeviren, M., Ye, E., Mallapragada, S. K., Sakaguchi, D. High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies. J. Vis. Exp. (95), e52242, doi:10.3791/52242 (2015).
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