神経保護戦略のための治療因子の送達のために設計成体幹細胞の高スループット特性評価

96ウェルプレートのための1。基板の準備 （ 図1）検査対象の異なる基板と細胞型を概説し、96ウェルプレートのマップを作成します。 ストック異なる基質溶液[ポリ-L-リジン、フィブロネクチン、I型コラーゲン、ラミニンおよびエンタクチン、コラーゲンIV、ラミニン（ECL）]、96ウェルマルチウェルプレートを入手し、無菌細胞培養でワークステーションを準備フード。 （この濃度は、以前に、細胞の成長および増殖のための基質濃度依存的アッセイに基づいて決定した）を5μg/ mlの最終濃度になるように滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中でストックを希釈することにより、個々の基板を用意する。無菌の貯水池に注ぐ前にボルテックスを用いて混ぜる。 96ウェルマップ（ 図1）に応じて、各ウェルに100μlの基質溶液を加える（12ビットまたは8チャンネルのマイクロピペットは、96ウェルプレートにマイクロピペッティングのために便利である）。パラフィルムのストリップを使用して96ウェルプレートに蓋を密封し、4℃で一晩保存する。 2.細胞のプレーティングとタイムラプスイメージング注：マウスMSCを、成体C57BL / 6マウスの骨髄から単離し、そして接着細胞株として維持した。レンチウイルスベクターのエンコーディングBDNF（LV-BDNFを使用して、およびグリア細胞由来神経栄養因子（ヒトcDNA GDNF）; MSCは、脳由来神経栄養因子（ヒトcDNA BDNF）を分泌するためにそれらを設計するレンチウイルスベクターを使用して感染したCMV-BDNF-IRES -GFP）、GDNF（LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP）、および緑色蛍光タンパク質（GFP、LV-GFP; CMV-GFP）。 注：マウスの​​間葉系幹細胞のための培養培地（MSCは）10 mg / mlのストレプトマイシン、10％ハイブリドーマ修飾ウシ胎児血清、10％ウマ血清、2mMのL-グルタミン、10,000 U / mlのペニシリンを含有するイスコフ改変ダルベッコ培地である。マウスのMSC（MSCは、GFP-MSCの5種類、BDNF-GFP-MSCを、GDNF-GFP-MのSCおよびBDNF / GDNF-GFP-MSCは）T75細胞培養フラスコ中で約30％コンフルエンスで播種した。 細胞のプレーティング 二回、翌日、吸引により基質溶液を除去し、滅菌PBSの約200μlで各ウェルをすすぐ。最後のPBSでリンスした後、各ウェルに細胞培養培地を（200μl/ウェル）を加える。 37℃に設定し、細胞培養インキュベーター中に96ウェルプレートを置き、平衡化のため、5％CO 2。 96ウェルプレートをインキュベーター内で平衡化されている間、T75フラスコから（馴化培地とも呼ばれる）の増殖培地を回収し（T75フラスコ中のMSCが収穫/めっき時に約70％コンフルエントであるべきである）細胞を採取し無菌条件下で15ミリリットルコニカルチューブに保存する（この条件培地は、以下のステップ2.1.4で使用されます）。 フラスコに滅菌PBSの8ミリリットルを加え、穏やかに旋回した後、PBSをオフにピペットで0.05％トリプシンの1ミリリットルを追加し、0.01％T75フラスコの培養表面から細胞を剥離するEDTA溶液。位相差光学系を搭載した倒立顕微鏡を用いてフラスコを表示することにより、細胞の剥離を監視します。 細胞が剥離したら、すぐにフラスコに（ステップ2.1.2収集）馴化培地の8ミリリットルを追加します。細胞懸濁液を収集し、15ミリリットルコニカル遠心チューブに移し、細胞をペレットに450×gで4分間遠心する。 上清を除去し、新鮮な200μlの細胞ペレットを再懸濁し（37℃）で細胞培養培地を温め。 血球計数器を使用してパンブルー生細胞数を実行することによって細胞懸濁液中の細胞数を決定します。約300細胞/ウェルの密度に96ウェルプレートの適切なウェルに細胞をプレー。 細胞の各集団のためにこれらのステップを繰り返します。 タイムラプスイメージング MSCの全てがメッキされた後、場所2時間インキュベーターに96ウェルプレートは、MSCが基板に付着することを可能にする。 HCSシステムを起動し、平衡化するためのシステムのために2時間待つ。 37℃までの環境制御装置を設定し、一定の空気供給源HCSシステム環境チャンバに空気中5％CO 2を含む混合ガスシリンダを接続する。 2時間の平衡期間以下のインキュベーターから96ウェルプレートを取り外し、HCSシステムの細胞増殖チャンバ内に直接配置します。平衡化のための30分は、プレートのあらゆる熱関連の拡張を考慮して、プレートの設定を構成する画像取得と解析ソフトウェアを起動できるようにします。 イメージングのための20X目的​​を選択します。 [ すなわち、などフィブロネクチン上のGFP-MSCを（×2回の反復30条件=合計で60ウェルの合計6基材×5 MSCサブタイプ）]タイムラプスイメージングを設定するための条件あたり2つのウェルを選択します。とイメージングのための2つのサイトを選択してください各ウェル中。 イメージングのための正しい光の波長を選択してください。 注：二つの異なる波長（位相コントラスト及びGFP蛍光）はタイムラプスイメージングのために選択した。 レーザーオートフォーカスを使用して、井戸の底に焦点を当て、最適化された焦点面を見つけるために、複数のサイトや複数のウェル用のテスト画像を撮影する。 フォーカスが確立されると、すべての60ウェル（120部位）のための48時間の画像ごとに5分のキャプチャを開始する。 HCSシステムからの96ウェルプレートを除去することにより、細胞を24時間ごとにフィード。各ウェルから培地75μlのを削除し、各ウェルに100μlの新鮮な培地を加える（37℃で新鮮な培地を平衡化し、5％CO 2）。 タイムラプス実験の終わりに、HCSシステムからの96ウェルプレートを取り外します。無菌条件下で、各ウェルからの馴化培地試料を収集し、別の96ウェルプレートに、これらのサンプルを移す。 注：これらのサンプルは、さらにanalysのために使用することができる神経栄養因子のためのELISAを実行することによってである。 （詳細は下記を参照のこと）などのKi67の細胞増殖アッセイまたはヨウ化プロピジウム生/死染色アッセイなどの追加アッセイ用培養したMSCを96ウェルプレートを準備します。 セクション5以下で説明するように、細胞遊走/細胞追跡用のタイムラプスイメージング解析を行う。 3. Ki67の細胞の増殖およびヨウ化プロピジウムライブ/デッドアッセイ Ki67の細胞増殖アッセイ（免疫細胞化学） 0.1 Mリン酸（PO 4）を有する細胞培養物は1分間2回リンスバッファー。室温で20分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で文化を修正。 PFAを削除し、7分3回PBSでウェルをすすぐ。 最後のすすぎの後、各ウェルに遮断溶液100μl（リン酸緩衝生理食塩水、5％正常ロバ血清、0.4％ウシアルブミン血清及び0.2％トリトンX-100）を追加ND 1時間室温でインキュベートする。 200：1の作業割合でブロッカー溶液中で希釈することにより、一次抗体、ウサギ抗Ki67のを準備します。 ブロッカー溶液を除去し、各ウェルに一次抗体溶液100μlを適用します。 96ウェルプレートをカバーし、4℃で一晩、サンプルをインキュベートする。 翌日、抗体溶液を除去し、7分、3回PBSですすぎます。 500：1の加工率​​でブロッキング溶液中で二次抗体、ロバ抗ウサギCy3のを準備します。 100：1の希釈で二次抗体溶液にDAPI核染色を追加します。最後のPBSリンスを除去した後、各ウェルに二次抗体/ DAPI溶液100μlを加える。 90分間、室温、暗所でインキュベートする。 二次抗体/ DAPI溶液を除去し、7分間PBSで各ウェルをすすぎ、3回。画像化されるまで4℃で96ウェルプレートおよびストアをカバーする。 Propidiumヨウライブ/デッドアッセイ後述のようにヨウ化プロピジウム（PI）排除アッセイによって細胞死を測定する。 培養培地中の1.5μMの濃度のヨウ化プロピジウム染色液を準備します。 それらの細胞を死滅させることを意図して、2分間MSCの1ウェルに70％エタノールを100μlを追加します。この井戸は、PI染色の陽性対照として役立つ。 MSCの大部分は、PI染色細胞死を示すであろう。エタノール溶液を除去します。 各ウェルに、ヨウ化プロピジウム染色溶液100μlを加え、5％CO 2インキュベーター中で37℃で20分間インキュベートする。 1分、2回の0.1 Mリン酸緩衝液で細胞をリンスする。室温で20分間、0.1M P0 4バッファに4％PFAを用いて細胞を固定してください。 PFAを削除し、7分間PBSで3回すすいでください。 室温で1時間遮断溶液中に希釈されたDAPI溶液（1:50）でインキュベートする。で全てのウェルをすすぐ7分間、PBS、3回。 DAPI溶液を除去し、7分間PBSで各ウェルをすすぎ、3回。画像化されるまで4℃で96ウェルプレートおよびストアをカバーする。 4.自動イメージングと多波長スコアリング分析 96ウェルプレートをロードHCSシステムに（以前のKi67免疫標識またはヨウ化プロピジウム染色のために処理される）、20分のHCSシステムの画像収集および解析ソフトウェアを開き、プレートを平衡化させる。 細胞は自動露出機能を利用して存在し、関心のある各波長のオフセットを計算したZ-プレーンを探す1でビニングカメラと2のゲイン設定を使用して、10倍の対物レンズの取得設定を選択します。この分析のために、DAPI（W1）、Cy3で（W2）、およびFITC（W3）のための画像をキャプチャ。陰性対照ウェルは、画像取得のためのシグナルを示さないが​​できる最大強度レベルを選択する。この設定は、POSに適して確認してくださいitive井戸。 プレートを取得。画像をキャプチャし、画像取得と解析ソフトウェアのデータベースに格納します。 画像いったん上記取得した画像から、オープン画像収集と分析、オフラインのソフトウェアとレビュー版データを取得されている。 多波長スコアリング分析を選択します。各波長の最小値と最大強度を設定します。 注：DAPI検出は各可視核の周りに染色をマークする必要があります。 Cy3では、Ki67の免疫反応性（IR）で陽性の細胞を検出する必要があり、負のコントロールの下でIRを検出しないでください。 Cy3のKi67のIRについては、おおよその最小幅は7であった、おおよその最大幅は30であった、地元のバックグラウンドを超える強度が150グレーレベルであり、最小染色面積は、50μm2であった。 すべてのポジションのために分析を実行します。スプレッドシートに表示するデータをエクスポートします。 5.細胞追跡オープン画像acquisitionおよび解析プログラムとをクリックして「レビュープレートデータ[DB] …」は、目的のプレートを選択する。 "まあ対時間」としてデータを表示します。 所望の選択を左クリックして、「サイト」セクションからのサイトのいずれかを選択します。選択して下の "…送信された「"波長： "。右96ウェルプレートテンプレートでよくターゲットをクリックして、「ロードイメージ」をクリックしてください。 "アプリ"とし、 "トラック·オブジェクト」をクリックすることで、細胞を追跡します。 例えば 、Microsoft Excelのデータをエクスポートする形式を選択して「ダイナミックデータエクスチェンジ（DDE）」を使用してください。 起源、デルタxとデルタyに例えば輸出、 経過時間、オブジェクト番号、距離、時間間隔、速度、絶対角度、距離に追跡データを選択する。 標的細胞上の「Ctrlキー+左クリック」で関心の各セルにタグをつける。 トラック細胞。必要に応じて、停止/「ESC」キーを用いて細胞の不適切な追跡を変更し、設定を調整します。 細胞追跡が完了したら、「ログデータ」を使用してデータを保存します。