JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

דור של פלסמיד וקטורים לבטא חלבונים מתויג FLAG על פי תקנות ההסדרה של יזם אדם התארכות Factor-1α שימוש גיבסון עצרת

Published: February 09, 2015
doi:
10.3791/52235
,
1Department of Cell Biology and Biochemistry,Texas Tech University Health Sciences Center

Summary

Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.

Abstract

ההרכבה גיבסון שיבוט (GA) מציעה אלטרנטיבה מהירה, אמינה, וגמישה לשיטות שיבוט DNA קונבנציונליות. אנחנו השתמשנו GA ליצור פלסמידים מותאמים אישית לביטוי של גנים אקסוגניים בתאי גזע העובריים של עכבר (mESCs). ביטוי של גנים אקסוגניים תחת שליטתו של SV40 או מקדמי ציטומגלווירוס אדם פוחת במהירות לאחר transfection לmESCs. תרופה לביטוי מצומצם זה היא להשתמש במקדם אלפא התארכות גורם האנושי-1 (hEF1α) לנהוג ביטוי גנים. וקטורי פלסמיד המכילים hEF1α אינם כזמינים לציבור רחב ככל SV40- או פלסמידים המכיל CMV, במיוחד אלה 3xFLAG-תגי N-terminal גם מכילים. הפרוטוקול המתואר כאן הוא שיטה מהירה ליצירת פלסמידים להביע CstF-64 וCstF-64 מוטציה FLAG מתויג תחת הרגולציה דרכי ההבעה של אמרגן hEF1α. GA משתמש בתערובת של exonuclease DNA, DNA פולימראז ואנזים DNA לעשות שיבוט של חופף קצוות של שברי DNA אפשריים.בהתבסס על DNAs התבנית היה לנו זמין, עיצבנו מבנינו שהתאספו לתוך רצף אחד. העיצוב שלנו השתמש בארבעה שברי DNA: עמוד השדרה 3.1 וקטור pcDNA, חלק אמרגן hEF1α 1, חלק hEF1α אמרגן 2 (שהכיל 3xFLAG תג נרכש כקטע DNA סינטטי פעמיים תקועים), וגם מוטציה CstF-64 CstF-64 או ספציפית. הרצפים של קטעים אלה הועלו לכלי דור פריימר לתכנן פריימרים PCR מתאימים ליצירת שברי DNA. לאחר PCR, שברי DNA היו מעורבים עם הווקטור המכיל את הסמן סלקטיבית ותגובת שיבוט GA הורכב. פלסמידים ממושבות חיידקים הפכו בודדות היו מבודדים. מסך פתיחה של פלסמידים נעשה על ידי עיכול הגבלה, ואחריו רצף. לסיכום, GA אפשר לנו ליצור פלסמידים מותאמים אישית עבור ביטוי גנים ב 5 ימים, כוללים לבנות מסכים ואימות.

Introduction

נהלי שיבוט DNA קונבנציונליים להסתמך על השימוש באנזימי הגבלה לדבוק האנזים DNA ו- DNA להצטרף לברי DNA ביחד. דור של בונה ביטוי מותאמת אישית המכילה קטעי דנ"א שונים הוא הליך רציף הכולל מחשוף של DNA עם אחד ו / או endonucleases הגבלה מרובה וההכנסה הבאה של קטעי DNA באמצעות קשירה. החסרון העיקרי של שיטה זו הוא שאנזימי הגבלה מתאימים לאחד מברי DNA עלולים להיות קשים לזהות (כלומר, ייתכן שיש כמה אתרי מחשוף) טיוח שיבוט DNA מוצלח של החלבון באורך המלא של עניין בלתי אפשרי. לכן, דור ביטוי מותאם אישית בונה תחת הרגולציה תעתיק של יזמי סוג ספציפי תא יעיל עם חלבון-תגים מותאמים אישית דורש תכנון זהיר מאוד. כמו כן, טכניקת זמן וגוזל עבודה. לאחרונה, כמה דיווחים תיארו מתודולוגיות להרכיב multipשברי DNA הסינתטי שונים le ברצף מתמשך באותו הזמן בשתי תגובות אחת או שתיים צעד ללא השימוש באנזימי ההגבלה 1-3. התגובה חד-השיבוט (לא כולל את כל שלבי ההכנה), תלויה בשימוש בתערובת של exonuclease DNA, DNA פולימראז, האנזים DNA 2,3 והקצוות החופפים של שברי DNA (איור 1). מאחר ואין שימוש באנזימי הגבלה, שברי DNA בכל גודל ובהרכב רצף (לא כולל רצפים חוזרים מאוד) ניתן התמזגו יחד במבנה חלק. לאחרונה, ערכה מסחרית (הרכבה גיבסון; GA) לתגובות שיבוט צעד אחד הפכה זמינה. ערכה זו מאפשרת הרכבה מהירה ויעילה עלות של כל קטעי DNA בוקטור יחיד עם מקדמים מותאמים אישית ותגי חלבון.

וקטורי ביטוי פלסמיד הזמינים באופן נרחב בשימוש כדי לבטא חלבונים אקסוגניים בדגמי תרבית תאי יונקים הם לעתים קרובות תחת reg תעתיקulation של ציטומגלווירוס הנגיפי (CMV) או וירוס 40 יזמים קופיים (SV40). יזמים נגיפיים אלה מספקים ביטוי חולף חזק של החלבונים אקסוגניים ברוב דגמי תרבית תאי יונקים מבוססים. עם זאת, דור של שורות תאי יציבות להביע חלבונים אקסוגניים הוא לעתים קרובות לא מוצלח בגלל השתקת תעתיק של CMV או מקדמי SV40 במהלך 4,5 תהליך ההקמה. בנוסף, יזמי SV40 וCMV נגיפי לא מספיק לקדם את הביטוי של חלבונים אקסוגניים בתאים מהשושלת הלימפה או תאי גזע עובריים 6,7. הפתרון למגבלה המובנית של יזמים נגיפיים הוא להשתמש יזמים מכוננים חזקים שאינם נגיפיים 8-10. אמרגן אחד מאופיין היטב חזק מכונן שאינו נגיפי ממקור האנושי הוא אמרגן 1α גורם התארכות (hEF1α) (hEF1α מעורב בקטליזה של עמותת GTP-התלוי של aminoacyl-tRNA לריבוזומים 11). עם זאת,וקטורי ביטוי המכילים את אמרגן hEF1α אינם כזמינים לציבור רחב ככל הנגיפי-אמרגן המכיל פלסמידים, במיוחד אלה המכילים גם 3 × FLAG בסוף מסוף אמינו של החלבון של עניין.

חלבון 64,000 MW גורם גירוי מחשוף (CstF-64) מעורב בעיבוד סוף '3 ​​של רוב mRNAs 12,13, כולל mRNAs היסטון שכפול תלוי 14,15. CstF-64 באו לידי ביטוי בכל הרקמות סומטיות 12. מוטיב הכרת RNA נקשר לרצפי RNA GU העשירים בתמלילים המתהווה במורד הזרם של אתר המחשוף וpolyadenylation 16. זה מחייב של CstF-64 להרנ"א הראשוני מקדם מחשוף endonucleolytic יעיל לתמליל המתהווה.

כאן, פרוטוקול מתואר המשתמש בהגברת PCR של שברי DNA, ערכת גיבסון שיבוט הרכבה (הכוללת תאי חיידקים כימיים מוסמכים) כדי לייצר וקטורי מנהג מ 'מתויג 3xFLAGouse CstF-64 או CstF-64 מוטציה לסוף מסוף אמינם תחת הביטוי של אמרגן hEF1α 1.

Protocol

1. סיליקו העיצוב של פלסמיד והדור של Primers החופף הערה: המטרה של צעד זה היא להרכיב רצף נוקליאוטידים מלא של המבנה ועיצוב פריימרים ללשמש כדי ליצור שברים עם חופף קצוות לשיבוט GA. לעצב רצף נוקליאוטידים רציף לייצג פלסמיד הסופי. להשיג או לפרט את פלסמידים בפועל ושברי DNA שישמשו כתבניות בPCR. הערה: שברי DNA שאינם זמינים – כמו שילוב של תגים ויזמים שונים – ניתן להזמין כברים בודדים או מרובים סינטטי פעמיים תקועים DNA (sDNA). שברים אלה הם זמינים באופן מסחרי בעלות נמוכה יחסית ויכולים להיות עד 2 קילו באורך (ראה טבלה של חומרים). מחלקים את רצף נוקליאוטידים הרציף של המבנה התאסף בשלב 1.1 לרסיסי DNA מתאימים לPCR. Confirמ 'שהברים להתאים פלסמידים זמינים ושברי sDNA. הימנע DNA שברים קטן יותר מ -200 NT. גש לכלי דור פריימר (ראה טבלה של ציוד). בחר בתפריט "העדפות הגדר". בחר הגדרות מתאימות על ידי לחיצה על הכרטיסייה "prefs שנה" בחלון "הגדרות גיבסון עצרת שינוי" המוקפץ. הערה: עיצוב פריימר גם יכול להתבצע ללא שימוש בכלי דור פריימר. עם זאת, השימוש בכלי דור פריימר מפשט את התהליך. להתחיל לבנות את המבנה על ידי בחירה בתפריט "בנה Construct". הכנס את שברי DNA פילוג ברצף פריימר כלי דור מ5 'ל 3' הסוף. הערה: קטע DNA משמש כעמוד שדר פלסמיד ניתן לחלק בנוחות לשני חלקים. במוצר הסופי PCR 'סוף הקטע הראשון זה ו3' 5 סוף הקטע האחרון קשורים יחד בDN אחד הרציףבר המייצג את עמוד השדרה הווקטור. הדבק את קטע DNA הראשון מייצג סוף '5 של ה- DNA הווקטור בפורמט FASTA (ייצוג המבוסס על טקסט של רצף נוקליאוטידים) לתוך החלון המוקפץ "Enter וקטור או הכניסו בר". שם קטע DNA. לבחור את הדרך המתאימה כדי להשיג את קטע DNA, או כPCR, RE Digest או סינתזה. לחץ על הלשונית "ההמשך". אם יש צורך להוסיף נוקלאוטידים נוספים / אתרי הגבלה בצומת של המבנה הסופי להשתמש ברווחי "spacer Fwd או פריימר Rev" שנקבעו בחלון "הוסף בר להכניס להרכבה". להוסיף נוקלאוטידים נוספים / אתרי הגבלה רק לאחד ברי DNA ולא לשני הברים. לחץ על לשונית "עשתה". חזור על פעולה עבור כל הקטעים עד המבנה הושלם. בחר את התפריט "תצוגת Primers" ולסקור את רצפי פריימר. חזור על פעולה עבור כל המבנים (וקטור בackbones ומוסיף), או לברי DNA שהם שונים. 2. הגברה של שברי DNA על ידי PCR באמצעות חם התחל הגהה DNA פולימראז (2x מיקס מאסטר) הערה: המטרה לצעד זה היא להשיג DNA מספיק לתגובת ההרכבה באמצעות PCR. לרכוש פריימרים PCR נועדו בשלב הקודם כמוצרי desalted ובקנה המידה הקטנה ביותר האפשרית. לדלל אותם עד 10 מיקרומטר במים או TE (10 מ"מ טריס-HCl, pH 7.9, 1 mM EDTA). לרכוש ברי DNA שאינם זמינים שברי sDNA. לדלל את כל שברי DNA, כולל שברי sDNA שישמשו כתבניות לPCRs לng 1 / μl במים. להרכיב את תגובות PCR בטמפרטורת חדר. בקצרה, להשתמש 2.5 μl (10 מיקרומטר מפתרון מניות) של כל צבע יסוד בהתאמה של זוג פריימר, μl 1 (מng 1 / פתרון μl מלאי) של קטע DNA התבנית, 25 μl של פולימראז החם הגהה התחלת DNA (DNA pol; תערובת אמן 2x; ראה טבלה של חומרים) ו -19 מים μl. מערבבים את הצינור על ידי מצליף עדין ולאסוף את טיפות נוזל על ידי צנטריפוגה הקצרה. להגביר בו-זמנית בצינורות נפרדים שברי DNA בגודל דומה על פי ההמלצות לpol DNA. בצע 25 – 28 מחזורי PCR או לקבוע את מספר המחזורים שמייצרים תשואת DNA מספיק. הפעל 10% מPCR נפח התגובה (5 μl) על ג'ל אלקטרופורזה agarose סטנדרטי מוכתמת ethidium ברומיד (0.2 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי). ודא שלהקת DNA בודדת המייצגת את מוצר ה- PCR גלויה. לקבוע את הגודל וכמות היחסית של שברי DNA תוך שימוש בסטנדרטי משקל מולקולרי DNA. אם יש צורך, לחזור על PCR להשיג כמות מספקת של שברי DNA. 3. DpnI עיכול של מוצרי PCR הערה: המטרה של צעד זה היא DIGEDNA פלסמיד st שייר התבנית מPCRs בסעיף 2. DpnI יהיה לעכל את פלסמיד דנ"א רק אם הוא מפוגל, כגון מתרחש לפלסמיד DNA גדל בסכר + זני חיידקים. לכן, לא מתייחס בDpnI אם פלסמיד DNA ישמש כקטע DNA בתגובת GA. הוסף 2 μl של אנזים הגבלת DpnI לμl 45 של מוצרי ה- PCR מיוצרים בסעיף 2. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. המשך לסעיף 4 או הקפאה ב -20 ° C עד צורך. 4. טיהור וריכוז של שברי DNA על חרוזים מגנטיים DNA טיהור הערה: המטרה של צעד זה היא לטהר ולרכז את מוצרי ה- PCR שהושגו בסעיפים 2 ו -3 שיטות טיהור PCR אחרות עשויים לשמש גם כן. לאזן את חרוזים מגנטיים טיהור DNA לטמפרטורת חדר. מחדש להשעות את החרוזים על ידי vortexing הקצר. העבר את PCRs wi מראש מתעכל-DpnI ה לצינורות 1.5 מיליליטר ולהוסיף 81 μl של חרוזים מגנטיים טיהור DNA לצינור אחד. דגירה את התערובת בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. מניחים את הצינורות על האספן המגנטי למשך כ -2 דקות. מחק את הנוזל השקוף בעזרת פיפטה. לשטוף פעמיים עם 200 μl של 80% אתנול למשך 30 שניות. לאפשר את כדורים לייבוש. שמור את המכסה של הצינורות פתוחים, עם הצינורות ממוקמים על האספן המגנטי. מחדש להשעות את החרוזים המיובשים ב 10 μl של 10 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 2 דקות. ספין בקצרה לאסוף את הנוזל שבתחתית הצינורות. מקם את הצינורות על האספן המגנטי למשך 2 דקות. הסר 8.5-10 μl של הפתרון ברור ולמקם אותו בצינור שכותרתו מראש חדש. קבע את הריכוז של שברי DNA על ידי ספקטרוסקופיה UV (ראה טבלה של ציוד). תגובת 5. עצרת שיבוט וטרנספורמציה של המוצרים בE. coli <p class => הערה "jove_content": המטרה לצעד זה היא לחשב 3: 1 יחס של כנס: וקטור ולבצע את תגובת ההרכבה. השתמש של קטע DNA המייצג את עמוד השדרה הווקטור או קטע DNA נושא את הסמן סלקטיבית לפחות 100 ng. לחשב את העודף טוחנת פי 3 לברי DNA שישמשו כמוסיף. המרת טוחנת-העודף בNG צורך של להכניס כל אחד מסוים. הערה: דרך נוחה לעשות את החישובים היא להשתמש ביישום מבוסס אינטרנט (ראה טבלה של ציוד). לערבב כמויות המחושבות של שברי DNA בצינור PCR, להתאים את עוצמת הקול עד 10 μl. הוסף 10 μl של מיקס מאסטר GA (2x, ראה טבלה של חומרים). דגירה התגובה על 50 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 להרכבה של 4-6 שברים או 15 דקות להרכבה של 2-3 שברים בCycler תרמית PCR. להמשיך עם הפיכתו של מוצר ההרכבה בE. המוסמך coli או להקפיא את המוצרים ב -20מעלות צלזיוס, עד צורך. בצע את הליך ההפיכה המלווה את כימי או תאי אלקטרו מוסמכים. בדרך כלל, להשתמש 2 μl של תגובת ההרכבה לכל תגובת שינוי. לאחר השינוי הוא מלא, להפיץ את התאים הפכו על צלחות אגר בתוספת האנטיביוטיקה סלקטיבית המתאימה. 6. בידוד פלסמיד, הגבלת אנזים עיכול ורצף הערה: המטרה של צעד זה היא לבודד DNA פלסמיד מE. coli, אז כדי לאמת את המבנה על ידי עיכול הגבלה וסדר. הפץ כמה מושבות אחת לpreps מיני ובידוד פלסמיד. תרבות LB לילה מיליליטר שימוש 2-5 הנוזלית בתוספת האנטיביוטיקה מתאימה. לבודד את פלסמידים המקבילים על ידי ביצוע ההליך המתואר בערכת הכנת מיני המשמשת. לקבוע את הכמות וריכוז של פלסמידים שהושג באמצעות spectroפוטומטר. בצע עיכול הגבלה עם endonucleases הגבלה אחד או כמה ל~ 0.5 מיקרוגרם של פלסמידים המטוהרים. השתמש באנזימי הגבלה המספקים דפוס מובהק של מאפיין עיכול לבונת DNA. לאשר הצלחת שיבוט DNA על ידי רצפי DNA באמצעות פריימרים ספציפיים או סטנדרטיים. לנתח את נתוני רצף לדיוק.

Representative Results

זרימת עבודה של הפרוטוקול שאחרי מוצגת באיור 2 א. רצינו לשכפל CstF-64 וCstF-64 חלבוני מוטציה התמזגו 3xFLAG תג תחת הרגולציה דרכי ההבעה של אמרגן hEF1α (איור 2 ואיור 3). HEF1α פלסמיד המכיל ואחריו 3xFLAG-תג לא היה זמין לנו. עם זאת, פלסמידים הבאים היו זמינים: 3.1 pcDNA myc-שלו (; מתנה נדיבה ממיכאלה Jansen), פלסמיד המכיל hEF1α (מתנה נדיבה ממלאדן Yovchev) והעכבר CstF-64 פלסמידים 12 (איור 3). הרצף כולו למבנה (ים) הורכב באמצעות יישומי עריכת נוקלאוטיד וטקסט (איור 3; ראה טבלה של ציוד). בהמשך לכך, הרצף (ים) פוצל בארבע חתיכות נוחים (איור 2, בלוקים אדומים ואיור 3) המתאימות לDNAs פלסמיד הזמינים. p הגברהrimers נועדו שימוש בכלי פריימר דור (ראה טבלה של ציוד) עם אילוצים של 4-6 ברים עם חפיפה מינימאלית של 25 NT, שהוקם בחלון "הגדרות גיבסון עצרת שינוי" המוקפץ. אתרי הגבלת NheI וNotI נכללו בעיצוב פריימר לצורך זיהוי פלסמידים התאספו כראוי. אתר NheI ממוקם ברצף פריימר בין pcDNA 3.1 ו -5 הסוף 'של אמרגן hEF1α. אתר NotI נמצא אחרי קודון העצירה (UGA) של CstF-64 וpcDNA 3.1 עמוד השדרה וקטור. על העיכול בו-זמנית עם שני אנזימי קטע DNA המורכב של אמרגן hEF1α, 3xFLAG וCstF-64 או המוטציה CstF-64 ישוחררו (ראה להלן ואיור 2). Primers נצטוו בקנה המידה הקטנה ביותר האפשרית וdesalted. בחלקו השני של אמרגן hEF1α מכיל קטע DNA 3xFLAG תג (490 נ"ב, איור 2, איור 3) נרכש כבר sDNA בודד (יםEE טבלה של חומרים). שברי DNA משמשים בתגובת ההרכבה היו מוגברים באמצעות pol DNA (ראה טבלה של חומרים). שברי DNA של חלק אמרגן hEF1α 1, חלק hEF1α אמרגן 2, באורך מלא וCstF-64 המוטציה היו מוגברים במקביל בצינורות נפרדים במשך 28 מחזורים (איור 4 א), בעקבות ההמלצות של הספק של pol DNA (ראה טבלה של חומרים , עבור כל denaturation מחזור היו 7 שניות על 98 מעלות צלזיוס, חישול 45 שניות על 55 מעלות צלזיוס, התארכות 90 שניות על 72 מעלות צלזיוס). בתחילה, את עמוד השדרה pcDNA 3.1 היה מוגבר במשך 22 מחזורים (באמצעות אותם תנאים כאמור לעיל, למעט זמן התארכות, שהוקם עד 3 דקות ב 72 מעלות צלזיוס). עם זאת, תשואת DNA וכתוצאה מכך לא הייתה די כדי לשמש בתגובת הרכבה (איור 4 א). לכן, הגברה נוספת מבוצעת כדי להשיג DNA מספיק. מוצרי PCR להשיגed מתבנית פלסמיד יש מתעכל עם אנזים הגבלת DpnI כדי להסיר את ה- DNA פלסמיד, שאחרת היה לזהם את תוצרי תגובת הרכבה וכתוצאה מכך ויהיה לייצר מושבות חיידקים עמידות לתרופות חיוביות שגויות. לכן, מוצרי ה- PCR היו מתעכלים עם אנזים הגבלת DpnI, שדבק פלסמיד דנ"א-מפוגל חמי מפוגל ומבודד מסכר + E. זני coli. מוצרי ה- PCR שהושגו באמצעות שברי DNA סינטטיים, כתבניות לא צריכה להיות מעוכלות עם DpnI מאז DNA מסונתז כימי אינו מכילות בסיסים מפוגלים או-מפוגל חמי. שברי DNA היו מטוהרים ומרוכזים על חרוזים מגנטיים טיהור DNA (ראה טבלה של חומרים) כפי שמתוארים בשלב הפרוטוקול 4. PCRs לשדרת 3.1 וקטור pcDNA שולב יחד והסכום של חרוזים מגנטיים טיהור DNA משמש הותאם בהתאם. תשואת DNA נקבעהבאמצעות ספקטרופוטומטר (טבלה 1 וטבלה של ציוד). תגובות עצרת לCstF-64 וCstF-64 מבני מוטציה נאספו על קרח (טבלה 1). עודף טוחנת של פי 3 של קטעי DNA נחשבים "מוסיף" היה בשימוש (טבלה 1, איור 3). הנפח הסופי של שברי DNA המעורבים הותאם עד 10 μl עם מים ו -10 μl של תערובת אמן הרכבה (2x) נוספה. התגובות היו מעורבות וטופחו על 50 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. תגובת ביקורת חיובית גם התאסף על פי המלצת המדריך לערכת GA וטופחו בו-זמנית עם CstF-64 ומוטצית CstF-64 תגובות. כפי שהומלץ בפרוטוקול, 2 μl של כל אחד מתגובות ההרכבה הפכו בE. כימי המוסמך coli מצורף לערכת שיבוט הרכבה (ראה טבלה של חומרים). השינוי בוצע כמתואר בערכהמדריך ל. שיבוטים חיוביים נבחרו על צלחות / LB אגר אמפיצילין. 6 מושבות לכל תגובת הרכבה באופן אקראי נבחרו להיות מופצת. פלסמיד DNAs היה מבודד באמצעות ערכת מיני בידוד פלסמיד (ראה טבלה של חומרים). בעיכול סיליקון ושל המבנים עם הגבלת אנזימי NheI וNotI הביאו שני שברים בגדלים של 4590 נ"ב, 3,032 נ"ב לנ"ב CstF-64 ו4590, 2,711 נ"ב לCstF-64 מוטציה (איור 2 ואיור 4). עיכול עם הגבלת אנזימי HindIII וNotI הביאו שלושה שברים בגדלים הבאים: 5872 נ"ב, 1005 נ"ב, ונ"ב 745 (CstF-64) ונ"ב 5872, 1005 נ"ב, ונ"ב 424 (CstF-64 המוטציה, איור 2 ו 4C איור). ואכן, עיכול של פלסמידים המבודדים מוצג דפוסים האופייניים הצפויים (איור 4, C). שימו לב שבר DNA 424 נ"ב המיוצר על ידי מערכת עיכול עם HindIII וNotI של המוטציה CstF-64פלסמידים באיור 4C מוכתמים בחולשה בשל גודלו הקטן. 2 מתוך 6 פלסמידים מבודדים נשלחו על רצף. אנו רצף אמרגן hEF1α, וCstF-64 או מוטציה CstF-64 חלקים של המבנים כדי לוודא שאין מחיקות, הוספות או החלפות. אנו ממליצים בחום רצף של מבני DNA וכתוצאה מכך או כל פרוטוקול המבוסס על PCR. הרצף הראה כי אחד מכל פלסמיד רצף הכיל את הרצף הצפוי באזור של hEF1α, 3xFLAG-תג וCstF-64 או CstF-64 המוטציה. כל אחד מפלסמידים האחרים הייתה מוטציה נקודה הציגה במהלך ההגברה של קטע DNA המקביל. ביטוי של פלסמיד המכיל CstF-64 בתאי גזע העובריים של עכבר, המיוצר על כמות שפע של חלבון אקסוגני דומה לביטוי מהסוג בר 17. איור 1. ייצוג סכמטי של מנגנון גיבסון העצרת. שברי DNA עם חפיפת הקצוות נאספו isothermally ברצף מתמשך אחד. החפיפה מסתיימת ראשון לעסה בחזרה על ידי 5 exonuclease ', אשר הוא לחמם בהדרגה מומת. כתוצאה מכך, שברי DNA שונים עם קצוות חופפים יהיו לחשל isothermally. DNA פולימרז יהיה למלא את הפערים ואנזים DNA thermostable ligates ניקס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2. (א) תרשים זרימה של הפרוטוקול מתואר לשיבוט הרכבה. ייצוג (B) של פלסמיד, PGA-CstF-64 שנוצר באמצעות ערכת GA אדום – שברי DNA משמשים בתגובת ההרכבה:. PcDNA3.1; חלק אמרגן hEF1α 1 (hEF1a – 1); חלק hEF1α אמרגן 2 (hEF1a – 2) הורה כDNA סינטטי; עכבר CstF-64 (mCstF-64). כחול – מסגרות קריאה פתוחות. ויולט – יזמים נגיפיים ולא-נגיפיים. ירוקים -. אזורי מחשוף וpolyadenylation אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. תיבות איור 3. עיצוב של פלסמיד CstF-64 ההרכבה גיבסון. שחור מייצגות את שברי DNA שהיו זמינים לעצב הרכבה גיבסון יחידה CstF-64 ברצף סיליקון. בהמשך לכך, הרצף היה מחולק בארבעה חלקי DNA, שהיו מוגברים על ידי PCR. שים לב כי בשל גודלו הקטן של 3xFLAG תג הרצף תוכנן כsDNA יחד עם יחסי ציבור hEF1α omoter חלק 2. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. נציג (B): איור 4. PCR של שברי DNA המשמשים בתגובות השיבוט ועיכול אנזים הגבלת נציג של פלסמידים שהושגו () PCRs נציג באמצעות חם להתחיל תערובת אמן 2x באיכות גבוהה עבור קטעי DNA המשמשים בתגובות הרכבה. פלסמידים של hEF1α, CstF-64, pcDNA 3.1 מבנה (PGA-CstF-64) באורך מלא וhEF1α, מוטציה CstF-64, pcDNA 3.1 מבנה (PGA-mutCstF-64) מתעכל עם NheI וNotI. (ג) באותו פלסמידים כמו בB מתעכלים עם אנזימי HindIII וNotI."_blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. שם של שברי DNA גודל צפוי (נ"ב) Concn. (Ng / μl) מדולל ל( ng / μl) μl משמש בGA CstF-64 ממדולל μl משמש בGA mutCstF-64, ממדולל יחס (תוספות: vec) טוחנות pcDNA 3.1 (וקטור) 4618 158 חַי 1 1 hEF1_ חלק אמרגן 1 825 213 75 1 1 3: 1 אמרגן hEF1_ חלק 2 לCstF-64 516 229 50 1 3: 1 Cstf-64 1,796 161 חַי 1 3: 1 חלק אמרגן hEF1_ 2 לCstF-64 מוטציה 516 199 50 1 3: 1 CstF-64 מוטציה 1,448 201 171 1 3: 1 טבלה 1. תשואה של שברי DNA לאחר ריכוז בחרוזים מגנטיים, דילול והקים מתגובות ההרכבה.

Discussion

שימוש מוצלח של שיבוט GA יש קדמו תמיד על ידי עיצוב מדוקדק של המבנה השלם (איור 2 ואיור 3).

בדיקה קפדנית של רצפי פריימר שתוכננו על ידי כלי דור פריימר גם מומלצת מאוד. צבעי יסוד לGA ייתכן שנוצרו ללא שימוש בכלי דור פריימר. עם זאת, שימוש בכלי הוא מאוד ממליץ, כי זה מפשט את התהליך. בדרך כלל, פריימר לשיבוט GA חייב להיות שני רצפים שונים מבחינה תפקודית. הרצף הראשון הוא שבר-ספציפי DNA, ומאפשר ההגברה של הבר באמצעות PCR. הרצף השני חופף עם שבר הסמוך, אשר הכרחי להרכבת GA. רצף ה- DNA-בר-ספציפי אופייני יהיה 18-22 NT באורך. רצפי DNA ספציפיים-הבר משמשים כדי להגביר את אותו DNA חייבים להיות טמפרטורות התכה דומות ותוכן GC. רצף חופף צריך להיות לפחות 15NT באורך עם טמפרטורת התכה של לפחות 48 מעלות צלזיוס. ההרכבה של יותר מ -4 ברי DNA תחייב את הרצף החופף להיות לפחות 20 NT. חפיפה ארוכה יותר תאפשר סגוליות מוגברת של חישול וכתוצאה מכך שברי DNA שנאספו יותר כראוי. מומלץ להימנע מרצפים המוטים בGC או AT התוכן בפיתוח רצפים חופפים, כי רצפים מוטים עלולים לפגוע בהרכבת DNA נכונה.

כמו כן, אנו ממליצים להשתמש כביקורת שלילית, שלא צריך לייצר כל מושבות חיידקים עמידות לתרופות, רק קטע DNA המתאים לשדרת הווקטור בתגובת GA. לחלופין, אחד מברי DNA המרכיבים את "מוסיף" יכול להיות מושמט מתגובת GA, שאמורה גם לגרום ללא מושבות חיידקים עמידות לתרופות. הסיבה לא מושבות תגדל יהיה חוסר קצוות חופפים של שברי DNA הסמוכים, שתהפוך את ההרכבה של complפלסמיד ete.

בפרוטוקול מתואר, חופף רצפים של 25 NT כדי ליצור קבוצות פריימר שמשו, בגלל מספר שברי DNA משמש (איור 3). ההמלצה של אתר כלי דור פריימר (ראה טבלה של ציוד) היא להשתמש בלפחות 20 רצפים NT חופפים להרכיב 4-6 שברי DNA. בנוסף, יותר חופף רצף יבטיח את השלמה התקינה של גדילי דנ"א (ראה איור 1) להגדיל את מספר המוצרים שנאספו בצורה מדויקת.

נכון לעכשיו, כמה מערכות לשיבוט חלק זמינות. עם זאת, חלק מהמערכות אלה עדיין משתמש באנזימי הגבלה (כלומר, שער זהב שיבוט 18). אחרים משתמשים תערובות קניינית של אנזימים המבוססים על DNA פולימרז וירוס vaccinia וחלבון DNA המחייב יחיד גדיל מאותו המקור הביולוגי 19. שני המערכות מוגבלות בהשוואה לGA ידי השוראורך ter של חופף רצפים. משום רצפים חופפים קצרים יותר עשויים שלא לספק ספציפי מספיק לצעד חישול של שברי DNA סמוכים, טיוח ההרכבה התקינה של יותר מ 23 שברי DNA בעייתיים. חסרונות אלה אינם קיימים במערכת GA.

גודלו של שברי DNA להיות מוגברים צריך להיות גם נחשב, כדי שלא יעלו על גודל amplifiable מהימן על ידי PCR (כלומר, KBP פחות מ 8 באורך). אפילו עם השיפורים בתפקוד של polymerases DNA ב -10 השנים האחרונות, שברי DNA גדולים יהיו מוגברים עם פחות יעילות ודיוק. במידת הצורך, יכולים להיות שהושגו שברי DNA גדולים יותר ממקורות אחרים אלטרנטיבה לPCR, למשל, על ידי בידוד פלסמיד ועיכול DNA המתאים עם אנזימי הגבלה. באופן ספציפי, לפרוטוקול המתואר בכתב היד הנוכחי, רציונלים להשתמש PCR היה מבוסס שלנו בגודל של שברי DNA הזמינים, שהיה כל פחות מ5 KBP. אם יש יותר ממוצר אחד PCR זוהה על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose, טיהור ג'ל של גודל שבר הרצוי מומלצת שימוש בכל טכניקות ביולוגיה מולקולרית הזמינות או ערכות מתאימות. בפרוטוקול הנוכחי משמש DNA פולימרז thermostable (ראה טבלה של חומרים). עם זאת כל DNA פולימרז מתן איכות גבוהה ותשואה יהיה מתאים לשימוש עם פרוטוקול זה. אם polymerases DNA באיכות גבוהה שונה ממתואר בפרוטוקול זמין, השתמש בתנאים מוגדרים כמתואר בספרי ההדרכה המתאימה. בפרוטוקול הנוכחי, E. כימי מוסמך תאי coli משמשים שמסופקים עם ערכת GA. E. לחלופין, כימי או אלקטרו מוסמך ניתן להשתמש בזני coli כגון DH5α או DH10B.

ההרכבה שיבוט תערובת אמן 2x היא קלה לשימוש עם ידיים על השקעה מינימאליות של זמן. עם זאת, נדרש pipetting מדויק בגלל הנפחים הקטנים needed להיות מעורב יחד. טכניקת ביולוגיה מולקולרית טובה צריכה להיות למימוש בכל העת, כמו גם.

שיבוט GA מציע אפשרויות בלתי מוגבלות לבנייה של שברי DNA, פלסמידים ווקטורים, שהם יותר מ -3 kbp בגודל. בנוסף יש לו השפעה רחבה יותר בתחום של ביולוגיה סינתטית, משום שהיא מאפשרת סינתזה והרכבה של, למשל, הגנום כולו חיידקים (mycoides Mycoplasma) או שמרי כרומוזום (Saccharomyces cerevisiae) 20,21. הטכניקה גם לגבי שיבוט קונבנציונלי צריך ליצור מבנים חלקות.

לסיכום, שיבוט GA מציע אלטרנטיבה מהירה, אמינה וגמישה לתהליך שכפול DNA הקונבנציונלי.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות למיכאלה Jansen במרכז למדעי בריאות באוניברסיטת טקסס טק, Lubbock, TX ומלאדן Yovchev במרכז רפואי של אוניברסיטת פיטסבורג, פיטסבורג, פנסילבניה לpcDNA נדיבות מתן 3.1 myc-שלו () ופלסמידים המכילים מקדם hEF1α . מחקר שפורסם בפרסום זה נתמך על ידי מכון יוניס קנדי ​​שרייבר הלאומי לבריאות ילד והתפתחות אדם של המכון הלאומי לבריאות במספר הפרסים R01HD037109 (לCCM). תמיכה נוסף הייתה מלורה בוש המכון לבריאות אישה (לCCM ו- PNG). התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA) Integrated DNA Technologies We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available.
DNA purification magnetic beads Beckman Coulter A63880 Agencourt AMPure XP – PCR Purification system
Plasmid Isolation Mini Kit Omega Bio-Tek Inc D6942-01 E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I
Gibson Assembly Cloning Kit New England BioLabs E5510S
DNA polymerase  New England BioLabs M0494S Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix
DpnI New England BioLabs R0176S
NheI New England BioLabs R3131S
NotI New England BioLabs R3189S
HindIII New England BioLabs R3104S
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop device
EditSeq DNASTAR Part of Lasergene Core Suite
SeqBuilder DNASTAR Part of Lasergene Core Suite
Word Microsoft Part of  Microsoft Office
NEBuilder New England BioLabs primer generation tool: http://nebuilder.neb.com
NEBioCalculator New England BioLabs ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in enzymology. 498, 349-361 (2011).
  2. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature methods. 7, 901-903 (2010).
  3. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature methods. 6, 343-345 (2009).
  4. Bowtell, D. D., Johnson, G. R., Kelso, A., Cory, S. Expression of genes transferred to haemopoietic stem cells by recombinant retroviruses. Molecular biology & medicine. 4, 229-250 (1987).
  5. Challita, P. M., Kohn, D. B. Lack of expression from a retroviral vector after transduction of murine hematopoietic stem cells is associated with methylation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 2567-2571 (1994).
  6. Lutzko, C., Senadheera, D., Skelton, D., Petersen, D., Kohn, D. B. Lentivirus vectors incorporating the immunoglobulin heavy chain enhancer and matrix attachment regions provide position-independent expression in B lymphocytes. Journal of Virology. 77, 7341-7351 (2003).
  7. Meilinger, D., et al. Np95 interacts with de novo DNA methyltransferases, Dnmt3a and Dnmt3b, and mediates epigenetic silencing of the viral CMV promoter in embryonic stem cells. EMBO reports. 10, 1259-1264 (2009).
  8. Chan, K. K., Wu, S. M., Nissom, P. M., Oh, S. K., Choo, A. B. Generation of high-level stable transgene expressing human embryonic stem cell lines using Chinese hamster elongation factor-1 alpha promoter system. Stem cells and development. 17, 825-836 (2008).
  9. Chung, S., et al. Analysis of different promoter systems for efficient transgene expression in mouse embryonic stem cell lines. Stem cells. 20, 139-145 (2002).
  10. Qin, J. Y., et al. Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter. PloS one. 5, e10611 (2010).
  11. Lund, A., Knudsen, S. M., Vissing, H., Clark, B., Tommerup, N. Assignment of human elongation factor 1alpha genes: EEF1A maps to chromosome 6q14 and EEF1A2 to 20q13.3. Genomics. 36, 359-361 (1996).
  12. Wallace, A. M., et al. Two distinct forms of the 64,000 Mr protein of the cleavage stimulation factor are expressed in mouse male germ cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6763-6768 (1999).
  13. MacDonald, C. C., McMahon, K. W. Tissue-specific mechanisms of alternative polyadenylation: testis, brain, and beyond. Wiley interdisciplinary reviews. RNA. 1, 494-501 (2010).
  14. Sabath, I., et al. 3′-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. Rna. 19, 1726-1744 (2013).
  15. Yang, X. C., et al. A complex containing the CPSF73 endonuclease and other polyadenylation factors associates with U7 snRNP and is recruited to histone pre-mRNA for 3′-end processing. Molecular and cellular biology. 33, 28-37 (2013).
  16. Grozdanov, P. N., Macdonald, C. C. High-Throughput Sequencing of RNA Isolated by Cross-Linking and Immunoprecipitation (HITS-CLIP) to Determine Sites of Binding of CstF-64 on Nascent RNAs. Methods in molecular biology. 1125, 187-208 (2014).
  17. Youngblood, B. A., Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. CstF-64 supports pluripotency and regulates cell cycle progression in embryonic stem cells through histone 3′ end processing. Nucleic acids research. , (2014).
  18. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS one. 3, e3647 (2008).
  19. Irwin, C. R., Farmer, A., Willer, D. O., Evans, D. H. In-fusion(R) cloning with vaccinia virus DNA polymerase. Methods in molecular biology. 890, 23-35 (2012).
  20. Annaluru, N., et al. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science. 344, 55-58 (2014).
  21. Gibson, D. G., et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science. 329, 52-56 (2010).

Tags

Gibson AssemblyPlasmid VectorFLAG-tagged ProteinsHuman Elongation Factor-1α (hEF1α) PromoterMouse Embryonic Stem Cells (mESCs)CstF-64CstF-64 MutantDNA CloningPCRBacterial TransformationRestriction DigestionDNA Sequencing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1α Promoter Using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235, doi:10.3791/52235 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image