성인에서 장내 줄기 세포를 분리<em> 초파리</em> FACS로 Midguts는 노화 동안 줄기 세포 동작을 연구하기 위해
Summary
Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging.
Abstract
Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly in tissues that have a high turnover rate such as the intestinal epithelium. However, adult stem cells are also subject to aging processes and the concomitant decline in function. The Drosophila midgut has emerged as an ideal model system to study molecular mechanisms that interfere with the intestinal stem cells’ (ISCs) ability to function in tissue homeostasis. Although adult ISCs can be easily identified and isolated from midguts of young flies, it has been a major challenge to study endogenous molecular changes of ISCs during aging. This is due to the lack of a combination of molecular markers suitable to isolate ISCs from aged intestines. Here we propose a method that allows for successful dissociation of midgut tissue into living cells that can subsequently be separated into distinct populations by FACS. By using dissociated cells from the esg-Gal4, UAS-GFP fly line, in which both ISCs and the enteroblast (EB) progenitor cells express GFP, two populations of cells are distinguished based on different GFP intensities. These differences in GFP expression correlate with differences in cell size and granularity and represent enriched populations of ISCs and EBs. Intriguingly, the two GFP-positive cell populations remain distinctly separated during aging, presenting a novel technique for identifying and isolating cell populations enriched for either ISCs or EBs at any time point during aging. The further analysis, for example transcriptome analysis, of these particular cell populations at various time points during aging is now possible and this will facilitate the examination of endogenous molecular changes that occur in these cells during aging.
Introduction
오래된 성장의 피할 수없는 결과는 기능을 유지하기 위해 조직과 장기의 감소 능력이다. 성체 줄기 세포는 단 나이 유기체 같이 줄기 세포는 또한 생물학적 행동의 감소를 경험, 조직 항상성 및 장기의 기능을 유지하는데 필수적이다. 이는 장내 상피 세포와 같은 높은 회전율을 가지고 조직에 특히 해롭다. 세 줄기 세포의 특징은 게놈 손상 장애가 복구 메커니즘, 손상된 세포주기 조절 및 (1-3에서 검토) 줄기 세포의 정상적인 동작에 영향을 모두 misregulated 신호 전달 경로를 포함한다. 특정 신호 전달 경로를 조작하거나 특정 유전자를 쓰러 뜨린, 우리는 규제와 정상 줄기 세포 행동을 유지하는 자신의 역할에 대한 통찰력을 얻고있다. 이러한 실험의 대부분은 후보 분자 접근법이기 때문에, 우리는 중에 줄기 세포에서 발생 내인성 분자 변화에 대해 거의 지식을 가지고노화. 이 문제를 접근하는 한 가지 방법은 기존의 줄기 세포가 발현 프로파일 에이징 동안 크게 변화 분자를 식별하는 대 영 사체를 비교하는 것이다. 불행하게도, 생물학적, 기술적 문제는 지금까지이 방법에 관한 우리의 진행을 방해했다.
초파리 melanogaster의는 (4 검토) 표현형 노화 수명이 짧은 (60-70 일간) 및 전시회가 있기 때문에 노화를 연구하는 매우 적합 모델 생물이다. 또한, 초파리의 노화 과정은 온도에 의해 가속화 될 수있다. 29 ° C에서 파리를 유지하는 경우, 장 조직의 세 표현형은 이미 십오일 5 이후에 관찰 할 수있다. 또한, 초파리 유전자 조작의 과다에 대한 의무입니다. 특히, 초파리 중장 다른 신호 경로 및 환경 문제에 미치는 영향을 연구하기 위해 우수한 모델 시스템으로서 등장했다(6-10에서 검토) 노화시 장 줄기 세포 (ISCS)의 생물학. 초파리 장내 상피 세포는 높은 회전율 속도를 가지고 있으며, 남성 (11) 한 달에 한 번 여성의 모든 2 주 갱신하고있다. 초파리 중장에 상주 ISCS 이간질 자기 갱신 ISC 및 enteroblast (EB) (12, 13)라는 포스트 유사 분열 전구 세포를 생성하는 능력을 갖는다. EB는 흡수 장 세포 또는 분비 enteroendocrine 셀 하나에 구별합니다. 이 현재까지 명확 ISC 레이블 만 마커 조합은 전사 인자 달팽이 (ESG)과 노치 델타 리간드 (DL) (14)의 표현이다. 그러나 이것은 단지 젊고 건강한 장을위한 마찬가지입니다. 노화 동안, 중장 상피는 증식 15-17 ISC의 증가에 의해 특징된다. 또한, 비정상적인 노치 신호는 ISC의 딸 세포의 운명 결정을 방해EBS를 15 misdifferentiation을 유도한다. 이에 의해 세 중장에 선의 줄기 세포를 식별하기에 불충분 식 DL 렌더링 노치 시그널링 및 CO ESG 표현 및 DL에 대한 활성 세포의 축적을 초래한다. ISCS 사실을 식별하는 어려움은 지금까지 ISCS 내인성 노화 변화를 조사 할 수있는 능력을 방해하고있다.
우리는 ISCS와 EBS의 GFP의 발현 수준이 본질적으로 다른 노화에 걸쳐 다른 남아있는 ESG -Gal4, UAS-GFP 유전자 변형 플라이 라인을 활용하여이 문제를 다루어왔다. 유사한 접근법이 유충 neuroblasts 18,19 뉴런의 분리를 위해 설명되었다. 젊은이와 노인 ESG -Gal4, UAS-GFP 파리의 Midguts 해부 및 단일 세포로 분해되었다. 세포를 형광 활성 세포 분류 (FACS)를 사용하여 GFP 양성 세포에 대해 정렬 하였다. 흥미롭게도, 정렬 GFP 양성 CGFP의 형광 강도에 따라 별개의 두 봉우리로 분산 ELL 학생 (GFP 높은 GFP 낮음). 또한,도 셀 크기와 상관 개의 피크에서 GFP 양성 세포의 분포 : GFP 낮은 강도를 나타내 세포 작다고 GFP 및 높은 강도를 가진 반면, 덜 세분화 된 세포는 더 크고 더 세분화되었다. 이러한 관찰은이 작은 ISCS GFP 강도를 기초 FACS를 이용하여 적절한 순방향 산란 (FSC) 및 측면 스 캐터 (SSC)를 사용하여 설정 큰 EB를 구별 할 수 있다고 제안했다. 흥미롭게도, 2 개의 피크가 명확하게 분리 된 노화 중에 남아 있었다. 또한, 2 개의 피크의 비율은 노화 midguts 상술의 특징을 반영하는 방식으로 변경 : 대규모의 개수가 시간이 지남에 EB를 증가 misdifferentiated 즉있다. 이러한 결과에서 우리는 적절한 FACS 파라미터 설정을 사용하여 GFP 양성 세포에 대해 정렬하여 우리가 임의의 시점에서 D ISCS 및 EBS에 대한 풍요롭게 결론uring 노화.
요약하면, 우리는 모든 연령의 초파리 midguts에서, 두 개의 서로 다른 세포 집단, ISCS와 EBS에 대한 풍부하며 차세대 시퀀싱으로 추가 분석을 위해 이러한 세포를 분리하는 연구를 할 수있는 FACS 전략을 소개합니다. 이 강력한 방법은 줄기 또는 전구 세포의 풍부한 인구 고령화에 내재 된 내인성 분자 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이러한 연구로부터 얻어진 데이터는 의심 종간 노화에 중요 보존 된 분자의 식별을 용이하게한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 프로토콜은 이후 같은 차세대 시퀀싱으로 더 분자 분석에 사용할 수있는 젊은이와 노인 성인 초파리 midguts에서 ISCS를 분리하는 방법을 설명합니다. ESG -Gal4에서 GFP 양성 세포 인구의 FAC 정렬은, UAS-GFP 플라이 라인은 이미 여러 그룹 (21, 22)에 의해 달성되었다. 그러나, 지금까지 GFP 양성 세포의 두 가지 피크의 존재는 간과하거나 또는 과소되었다. 우리는이 분리뿐만 아니라, GFP 양성 세포의 2 개의 피크가 명확하게 분리 된 노화 동안 유지 하는게, 세포 유형 (EBS를 ISCS)의 두 개의 다른 개체군을 나타낸다는 것을 보여준다. 이 관찰은 관련성이 높은 노화 동안 줄기 또는 전구 세포를 공부에 관심이 연구자들에게 유용하다. 옛부터 midguts ISCS의 아이솔레이션에 세 중장 ISCS를 식별하는 분자 마커의 조합이 없다는 사실에 의해 저해되었다. 유일한 표식이 유를ISCS는 중장 (12, 13)에서 유일하게 나누어 세포이기 때문에 nambiguously 오래 중장에 ISCS를 식별 포스 histone3 (PH3)이있다. 그러나, PH3는 임의의 주어진 시점에서 줄기 세포의 분할 수는 후속 분석을 위해 ISCS 적당량을 얻기 위해서는 너무 낮기 때문에 ISCS을 분리 마커 부적합하다. 플라이 라인 ESG -Gal4, UAS-GFP는 ISC 기능, 유지 보수 및 분화를 연구 연구자들에 의해 사용되는 가장 일반적인 플라이 라인입니다. ISCS 항상성의 분자 규제에 대한 우리의 지식이 특정 분자와 신호 전달 경로가 조작 된 한 연구에 기초한다 (7 검토). 따라서, 우리는 여전히 노화 과정에서 발생하는 내인성 분자 변경 사항에 대한 지식이 부족하다. 본원에 기재된 방법은,이 갭을 닫고 ISCS 노화 중에 어느 시점에서 성인 midguts 크기, 입도 및 GFP 강도에 기초하여 분리 될 수 있다는 사실에 기초한다.
동안구축하고 우리는 다음 단계는 신뢰할 수있는 결과에 중요한 것으로 발견이 방법을 최적화. 약 200 배짱은 FAC 정렬을 위해 ISCS의 좋은 금액을 얻기 위해 해부 할 필요가있다. 해부의 속도는 매우 중요하고 개인의 관행에 따라 달라집니다. 교육을받은 개인은 20 ~ 30 분 이내에 40 배짱을 해부 할 수 있습니다. GFP는 또한 ESG -Gal4의 Malpighian 세뇨관에서 발현되기 때문에, UAS-GFP 플라이 라인 완전히 중장 Malpighian 세관을 제거하는 것이 필수적이다. 해부 midguts은 조직 저하를 방지하고 조직에서의 RNAse 활동을 줄이기 위해 멋진 환경에서 보관해야합니다. 따라서 해부 midguts 20-30 분 후에 최대 감기 1X PBS / 1 % BSA 용액을 함유하는 마이크로 원심 분리 튜브로 해부 접시로부터 옮기고 얼음에 보관해야한다. 그러나, 해부 midguts 트립신과 조직 분리를 시작하기 전에 이상 2 시간 동안 얼음에 남아 할 수 없습니다. 가장 effici엔트 방법은 다음이 2 시간 내에 가능한 한 파리의 많은 배치를 해부 트립신이 배치 다이제스트 시작하는 것입니다. 더 midguts가 필요하면, 이들은 트립신의 다이제스트 배양 시간 동안 해부 될 수있다.
트립신은 매우 강력한 효소 및 세포에 해로운 영향을 미칠 수 있지만, 우리는 여전히 충분한 생활, 이후 FAC 정렬을위한 건강한 세포를 얻을. 손상 세포의 분리를 허용 우리 절차 핵심 단계는 세포 해리 용액 트립신 매 30 분에서 제거된다는 점이다. 해부 midguts 실온에서 용액을 함유 트립신 2 ½ 시간 동안 배양하는 경우, 우리는 죽은 SYTOX 양성 세포의 20 ~ 30 %의 증가를 관찰 하였다. 그것은 우리가 사용하는 트립신 솔루션은 EDTA가 포함되어 있음을 지적한다. EDTA의 존재가 아마 세포 외 매트릭스 분자의 적절한 기능을 위해 필요한 칼슘 및 마그네슘 이온을 킬레이트 화하여 조직의 붕괴를 용이하게한다. </P>
젊은이와 노인의 용기에서 가장 중요한 단계에 성공적으로 정렬 ISCS는 FACS 및 설명 컨트롤을 사용하여 특정 분류 계층 구조를 다음 게이팅 매개 변수의 적절한 초기 설정입니다. 우리는 ARIA II 흐름 사이토 (FACSDiva 소프트웨어)에 정렬 FAC을 수행 하였다. 이 악기는 전에 레이저를 따뜻하게 정렬에 한 시간 이상 전원이 켜져 있는지 중요합니다. ISCS의 FAC 정렬이 처음으로 수행되는 경우에 참고로, 정렬 및 보상 요구에 대한 파라미터는, 상기 컨트롤을 사용하여 설정되어야한다 : (1) 야생형 세포를 해리 (예 1118 w) SYTOX 무첨가 초파리 midguts -이 매개 변수 (단계 4.4.1)를 설정하는 것은 자신의 형광도에 따라 세포를 정렬 방지; (2) SYTOX와 야생형 (예 : 1118 w) 세포 초파리 midguts 해리 추가 -이 매개 변수를 설정(단계 4.4.2) (죽은 세포는 높은자가 형광을 가지고 정렬 GFP 양성 세포를 오염시킬 수있는) 살아있는 세포에서 죽은 사람을 분리 할 수 있습니다; (3) ESG -Gal4의 midguts에서 세포를 해리, SYTOX없이 UAS-GFP 플라이 라인 -이 매개 변수를 설정한다 (단계 4.4.3)는 모든 GFP 양성 세포가 산포도 내에서 플롯되도록합니다. 이러한 매개 변수가 제대로 설정되지 않으면 정렬 된 세포 집단은 대부분 죽은 세포와 파편 (그림 5B, C), 많은 GFP 양성 세포 (그림 5D)를 놓친 것 등 GFP 양성 세포의 두 가지 피크를 포함합니다 히스토그램 플롯에서 볼 (그림 2E와 그림 3E)은 감지되지 않습니다. FACS 및 게이팅 매개 변수가 설정되고 나면, 장비는 교정 및 ESG의 -GAL4, UAS-GFP 플라이 라인에서 셀을 정렬 할 준비가되었습니다. 이러한 매개 변수가 저장 될 수 있기 때문에, 모든 미래는 ESG -GAL4, UAS-에서 ISCS와 EBS에 대한 세션을 정렬GFP 플라이 라인은 4.5 단계에서 시작할 수 있습니다. "순도"모드 선택 및 양방향 순도를 수행하는 정렬 정렬 세포의 수를 감소 있지만, 높은 엄격한 정렬한다 (단계 4.6 및도 4b, C)을 허용한다. 참고로, 죽은 세포를 라벨 대신 프로피 듐 요오드화 SYTOX 사용의 장점은 스필 오버를 쉽게 해결할 FITC (GFP) 채널로 둘러 유출 있다는 것이다.
ISCS 및 EBS에 대한 우리의 농축 방법은, 각각 상이한 GFP 발현 수준에 의한 세포 분류에 기초한다. 그것은 misdifferentiated 사채는 낮은 수준에서 GFP를 표현하고 ISCS로 오인 될 수있는 노화하는 동안 그 일 수있다. 정렬 된 세포는 크기와 입도에 차이가 있기 때문에, 우리는 우리의 정렬 전략 ISCS와 EBS에 대한 풍요롭게이 현재까지 가장 적합 함을 믿는다. 또한,이 ISC ID를 유지 중장 노화 세포는 핵이 작은 것으로 알려져있다 (15). 정렬 된 세포의 신원에 대한 자세한 선명도를 얻으려면 하나는 -GAL4는 ESG 전달하는 유전자 변형 플라이 라인, UAS-GFP 및 노치 신호 기자 유전자에서 세포를 정렬 할 수 있습니다. 노치 만 사채 12, 13에서 활성이있는 것으로 입증되었다 때문에, ISCS는 사채가 노치 기자에 긍정적 인 반면, 노치 기자에 대한 부정적인 것 젊은 중장입니다. 그러나시 노치 신호를 노화 중장 조직에서 비정상적된다. 따라서 설정이 실험이 실제로 더 ISCS 및 EB를 구별 할 신뢰할 수있는 오래된 중장에서 분리 여부를 테스트 할 필요가있다.
우리는 이미 젊은이와 노인 midguts에서 ISCS의 비교 전 사체 분석을 위해이 방법을 채택하고 노화 동안 차등 규제 요인을 확인했다 (unpub. observ.). 또한,이 방법과 ISCS 사채 간의 유전자 발현의 차이를 분석한다. 이러한 조사s는 세포 분화 과정을 들어갈 때 발생하는 초기 분자 변화에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다. 또한, 노화 및 후속 분석 중 사채의 분리는 연령에 의한 misdifferentiation의 분자 변화를 밝혀 줄 것입니다. 또한,이 방법은 유전자 기능을 연구하기 위해 사용되는 다른 초파리 유전 도구와 결합 될 수있다. 요약하면,이 방법은 노화 중 분자의 특성과 ISCS 및 사채의 변화를 조사하기 위해 공정한 접근 방식을 제공합니다. 이 성체 줄기 및 전구 세포 메커니즘을 노화의 탐사를 촉진하는 유용한 도구입니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Gabriele Allies for excellent technical assistance. We thank the University Ulm Medical Faculty for the use of the FACS Core Facility and the Institut für Molekulare und Zelluläre Anatomie for using the confocal microscope. We thank S. Hayashi for the esg-Gal4, UAS-GFP fly line. This project is funded by the Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Forschungskern SyStaR). A.T. is supported by SFB 1074 (Project A2). A.T. and G.A. are supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, FE578/3-1). H.M.T. is a member of the International Graduate School in Molecular Medicine Ulm (GSC 270).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Forceps: Dumont, Inox Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh) | Sefar | 3A03-0150-102-00 | |
| Falcon 5ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| Polymax 1040 | Heidolph | 543-42210-00 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A4503-50G | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly. |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry | Life Technologies | S34857 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7023 | other solutions, e.g. Trizol can be used for subsequent RNA isolation |
| FACSAria II cell sorter | Becton Dickinson | Turn on one hour prior to sorting |
References
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