عزل الخلايا الجذعية المعوية من الكبار<em> ذبابة الفاكهة</em> Midguts بواسطة FACS لدراسة سلوك الخلية الجذعية خلال الشيخوخة
Summary
Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging.
Abstract
Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly in tissues that have a high turnover rate such as the intestinal epithelium. However, adult stem cells are also subject to aging processes and the concomitant decline in function. The Drosophila midgut has emerged as an ideal model system to study molecular mechanisms that interfere with the intestinal stem cells’ (ISCs) ability to function in tissue homeostasis. Although adult ISCs can be easily identified and isolated from midguts of young flies, it has been a major challenge to study endogenous molecular changes of ISCs during aging. This is due to the lack of a combination of molecular markers suitable to isolate ISCs from aged intestines. Here we propose a method that allows for successful dissociation of midgut tissue into living cells that can subsequently be separated into distinct populations by FACS. By using dissociated cells from the esg-Gal4, UAS-GFP fly line, in which both ISCs and the enteroblast (EB) progenitor cells express GFP, two populations of cells are distinguished based on different GFP intensities. These differences in GFP expression correlate with differences in cell size and granularity and represent enriched populations of ISCs and EBs. Intriguingly, the two GFP-positive cell populations remain distinctly separated during aging, presenting a novel technique for identifying and isolating cell populations enriched for either ISCs or EBs at any time point during aging. The further analysis, for example transcriptome analysis, of these particular cell populations at various time points during aging is now possible and this will facilitate the examination of endogenous molecular changes that occur in these cells during aging.
Introduction
وهي نتيجة لا مفر منها لتقدم السن هي القدرة تقليل من الأنسجة والأعضاء على البقاء وظيفية. الخلايا الجذعية البالغة ضرورية للحفاظ على توازن الأنسجة وظائف الجهاز، ولكن كما من الكائنات العمر، والخلايا الجذعية أيضا تشهد انخفاضا في السلوك البيولوجية. هذا هو ضار بشكل خاص إلى الأنسجة التي لديها معدل دوران عالية، مثل ظهارة الأمعاء. وتشمل السمات المميزة للخلايا الجذعية الذين تتراوح أعمارهم بين الضرر الجيني، وآليات إصلاح المتضررة، وضعف تنظيم دورة الخلية ومسارات الإشارات misregulated، وكلها تؤثر على سلوك الخلايا الجذعية العادي (استعراضها في 1-3). عن طريق التلاعب مسارات إشارات محددة أو هدمت جينات معينة، لقد اكتسبت نظرة ثاقبة دورهم في تنظيم والحفاظ على سلوك الخلايا الجذعية العادي. لأن معظم هذه التجارب من النهج جزيء مرشح، لدينا القليل جدا من المعرفة حول التغييرات الجزيئية الداخلية التي تحدث في الخلايا الجذعية خلالالشيخوخة. طريقة واحدة لنهج هذا السؤال هو لمقارنة Transcriptome على من الشباب مقابل الخلايا الجذعية القديمة لتحديد الجزيئات التي تتغير بشكل ملحوظ خلال الشيخوخة الملف الشخصي التعبير. للأسف، أعاقت التحديات البيولوجية والتقنية تقدمنا بشأن هذا النهج حتى الآن.
ذبابة الفاكهة البطن هو كائن نموذج مناسب للغاية لدراسة الشيخوخة لأنه لديه لمدة قصيرة (حوالي 60-70 يوما) والمعارض الشيخوخة الظواهر (استعراضها في 4). وعلاوة على ذلك، يمكن تسريع عملية الشيخوخة في ذبابة الفاكهة في درجة الحرارة. عندما الحفاظ على الذباب في 29 ° C، وهو النمط الظاهري العمر في الأنسجة المعوية يمكن بالفعل لوحظ بعد 15 يوما 5. وعلاوة على ذلك، ذبابة الفاكهة غير قابلة لعدد كبير من التلاعب الجيني. على وجه الخصوص، برزت المعي المتوسط ذبابة الفاكهة كنظام نموذجا ممتازا لدراسة تأثير مسارات الإشارات المختلفة والتحديات البيئية علىبيولوجيا الخلايا الجذعية المعوية (ISCS) أثناء الشيخوخة (استعراضها في 6-10). ظهارة الأمعاء ذبابة الفاكهة لديها نسبة دوران عالية، وجددت كل أسبوعين في الإناث وعن مرة واحدة في الشهر في الذكور 11. ISCS المقيمين في المعي المتوسط ذبابة الفاكهة لديها القدرة على الانقسام وإنتاج ISC-متجدد النفس وخلية السلف ما بعد الإنقسامية يسمى enteroblast (EB) 12،13. وEB يفرق في إما خلية معوية الاستيعابية أو خلية enteroendocrine إفرازية. لهذا التاريخ، والجمع علامة الوحيدة التي تصف بشكل لا لبس فيه لتكاليف الدعم غير المباشر هو تعبير عن نزهة عامل النسخ (ESG) ويجند الشق دلتا (DL) 14. ومع ذلك، وهذا ينطبق على القناة الهضمية من الشباب والأصحاء فقط. أثناء الشيخوخة، يتميز ظهارة المعي المتوسط زيادة في انتشار ISC 15-17. بالإضافة إلى ذلك، يشير الشاذة الشق يعطل قرار مصير الخلايا الوليدة ISCويدفع misdifferentiation من EBS 15. وهذا يؤدي إلى تراكم الخلايا التي تنشط لإشارات الشق وشارك في التعبير عن ESG ودل، مما جعل دل التعبير غير كافية لتحديد بحسن نية الخلايا الجذعية في المعي المتوسط العمر. صعوبة في تحديد ISCS الحقيقية قد أعاق القدرة على دراسة التغيرات المحلية في ISCS الشيخوخة حتى الآن.
لقد تناولت هذه القضية من خلال الاستفادة من ESG -Gal4، UAS-GFP خط الطيران المعدلة وراثيا في أي مستوى من التعبير GFP في ISCS وEBS مختلفة بطبيعتها ويبقى مختلف أنحاء الشيخوخة. وقد وصفت نهج مماثل لعزل neuroblasts اليرقات والخلايا العصبية 18،19. تم تشريح Midguts من الشباب وESG -Gal4 القديمة، الذباب، UAS GFP وفصلها إلى خلايا واحدة. ثم تم فرز الخلايا لخلايا GFP إيجابية باستخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS). ومن المثير للاهتمام، وفرز GFP إيجابية جells موزعة على اثنين من قمم مختلفة تعتمد على كثافة GFP مضان (GFP عالية ومنخفضة GFP). وعلاوة على ذلك، فإن توزيع الخلايا GFP إيجابية في اثنين من القمم المترابطة أيضا مع حجم الخلية: كانت الخلايا التي عرضت منخفضة الكثافة GFP صغير وكانت أقل الحبيبية في حين أن الخلايا مع كثافة عالية GFP أكبر وأكثر الحبيبية. وتشير هذه الملاحظة أن ISCS أصغر يمكن تمييزها عن EBS أكبر باستخدام FACS على أساس كثافة GFP واختيار المناسب مبعثر إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC) الإعدادات. يثير الاهتمام والفضول، ظلت قمم اثنين من فصل واضح أثناء الشيخوخة. وعلاوة على ذلك، تغيرت نسبة من قمم اثنين في الطريقة التي يعكس بصمات المذكورة أعلاه midguts الشيخوخة: وهي أن عدد كبير، misdifferentiated زيادات EBS مع مرور الوقت. من هذه النتائج فإننا نستنتج أنه من خلال الفرز للخلايا GFP إيجابية باستخدام إعدادات المعلمة FACS المناسبة يمكننا إثراء لISCS وEBS في أي وقت نقطة دخلال شهر الشيخوخة.
وخلاصة القول، ونحن نقدم استراتيجية FACS التي تمكن الباحثين لإثراء لمدة السكان الخلية مختلفة، ISCS وEBS، من midguts ذبابة الفاكهة في أي عمر وعزل هذه الخلايا لمزيد من التحليل، مثل الجيل القادم التسلسل. يسمح هذا سيلة قوية لدراسة الآليات الجزيئية الذاتية التي هي ملازمة لالشيخوخة في سكان المخصب من الخلايا الجذعية أو السلف. فإن البيانات التي تم الحصول عليها من هذه الدراسات تسهيل مما لا شك فيه تحديد جزيئات المحفوظة والتي تكون مهمة في الشيخوخة عبر الأنواع.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف بروتوكول المعروضة طريقة لعزل ISCS من الشباب والكبار القديم midguts ذبابة الفاكهة، والتي يمكن أن تستخدم لاحقا لمزيد من التحليلات الجزيئية مثل الجيل القادم التسلسل. FAC الفرز من السكان خلية GFP إيجابية من ESG -Gal4، تم تحقيق-UAS GFP خط الطيران بالفعل من قبل العديد من الجماعات 21،22. ولكن، حتى الآن وجود اثنين من القمم متميزة من الخلايا GFP إيجابية تم إما التغاضي أو مقومة بأقل من قيمتها. وتبين لنا أن هذا الفصل لا يمثل سوى اثنين مجموعات مختلفة من أنواع الخلايا (ISCS وEBS)، ولكن أيضا أن اثنين من قمم خلايا GFP إيجابية تبقى منفصلة بوضوح أثناء الشيخوخة. هذه الملاحظة هي ذات أهمية كبيرة وقيمة للباحثين المهتمين في دراسة الخلايا الجذعية أو السلف أثناء الشيخوخة. وقد أعاق عزل ISCS من midguts القديمة من حقيقة أنه لا يوجد مزيج الواسمات الجزيئية لتحديد ISCS في المعي المتوسط العمر. العلامة الوحيدة التي شيحدد nambiguously ISCS في المعي المتوسط القديم هو الفوسفات-histone3 (PH3)، منذ ISCS هي تقسيم الخلايا فقط في المعي المتوسط 12،13. ومع ذلك، PH3 هو علامة غير مناسبة لعزل ISCS منذ عدد من تقسيم الخلايا الجذعية في أي نقطة زمنية معينة منخفض جدا من أجل الحصول على مبلغ محترم من ISCS للتحليلات لاحقة. وESG خط الطيران -Gal4، UAS-GFP هو خط الطيران الأكثر شيوعا التي يستخدمها الباحثون الذين يدرسون ISC وظيفة والصيانة والتمايز. ويستند معرفتنا الحالية بشأن تنظيم الجزيئي للISCS التوازن على الدراسات التي تم التلاعب بها جزيئات محددة ومسارات إشارات (استعراضها في 7). بالتالي، لا يزال يفتقرون إلى المعرفة عن التغيرات الجزيئية الداخلية التي تحدث أثناء الشيخوخة. طريقة هنا وصف يغلق هذه الفجوة، ويستند على حقيقة أن ISCS يمكن عزل بناء على حجمها وتحبب وGFP كثافة من midguts الكبار في أي نقطة زمنية أثناء الشيخوخة.
في حينإنشاء وتحسين هذه الطريقة وجدنا الخطوات التالية لتكون حاسمة لتحقيق نتائج يمكن الاعتماد عليها. تحتاج ما يقرب من 200 الشجاعة أن تشريح من أجل الحصول على كمية جيدة من ISCS لFAC الفرز. سرعة تشريح أمر بالغ الأهمية ويعتمد على ممارسة الفرد. ويمكن للفرد مدربين تشريح 40 الشجاعة في غضون 20-30 دقيقة. منذ يتم التعبير عن GFP أيضا في الأنابيب مالبيغي في ESG -Gal4،-UAS GFP خط الطيران، فمن الضروري لإزالة الأنابيب مالبيغي تماما من المعي المتوسط. يجب أن تظل midguts تشريح في بيئة باردة لتجنب تدهور الأنسجة وتقليل النشاط ريبونوكلياز في الأنسجة. ولذلك، يجب نقل midguts تشريح من الطبق تشريح في أنابيب microcentrifuge تحتوي الباردة 1X PBS الحل / 1٪ BSA بعد كحد أقصى من 20-30 دقيقة، وأبقى على الجليد. ومع ذلك، لا ينبغي أن يترك لتشريح midguts على الجليد لمدة أكثر من 2 ساعة قبل بدء تفكك الأنسجة مع التربسين. الأكثر efficiنهج الأنف والحنجرة هو تشريح العديد من دفعات من الذباب ممكن داخل هذه الساعة 2، ثم تبدأ التربسين هضم لهذه دفعات. إذا هناك حاجة لمزيد midguts، ويمكن تشريح خلال الأوقات حضانة التربسين هضم.
وعلى الرغم من التربسين هو انزيم قوية جدا، ويمكن أن يكون لها آثار ضارة على خلايا، ما زلنا الحصول عليها ما يكفي من المعيشة، الخلايا السليمة لاحق FAC الفرز. الخطوة الرئيسية الداخلي في أن يسمح لعزل خلايا سليمة هي أن تتم إزالة الخلايا فصلها من الحل التربسين كل 30 دقيقة. إذا حضنت midguts تشريح لمدة 2 ½ ساعة في التربسين التي تحتوي على الحل في درجة حرارة الغرفة، لاحظنا زيادة 20-30٪ في الخلايا الميتة، Sytox إيجابية. وتجدر الإشارة إلى أن الحل التربسين التي نستخدمها يحتوي على EDTA. وجود EDTA ربما يسهل تفكك الأنسجة التي كتبها مخلبية أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم اللازمة للوظيفة المناسبة من جزيئات المصفوفة خارج الخلية. </P>
أهم الخطوات الحاسمة بنجاح لنوع ISCS من الشجاعة الصغار والكبار هي الإعدادات الأولية المناسبة للFACS والمعلمات النابضة باستخدام عناصر التحكم وصفها وبعد تسلسل هرمي محدد الفرز. نحن إجراء FAC فرز على II تدفق عداد الكريات ARIA (البرمجيات FACSDiva). من المهم أن يتم تشغيل الأداة على ساعة واحدة على الأقل قبل الفرز في عملية الاحماء الليزر. من ملاحظة، عندما يتم تنفيذ FAC فرز ISCS لأول مرة، والمعلمات للفرز وضرورة التعويض الواجب تعيين باستخدام ضوابط المذكورة أعلاه: (1) فصل الخلايا من النوع البري (على سبيل المثال ث 1118) midguts ذبابة الفاكهة دون إضافة Sytox – تحديد هذه المعلمة (الخطوة 4.4.1) يمنع فرز الخلايا استنادا تألق ذاتي لهم. (2) فصل الخلايا من النوع البري (على سبيل المثال ث 1118) midguts ذبابة الفاكهة مع Sytox وأضاف – وضع هذه المعلمة(الخطوة 4.4.2) تتيح فصل القتلى من الخلايا الحية (الخلايا الميتة لها تألق ذاتي عالية، ويمكن تلوث الخلايا GFP إيجابية مرتبة)؛ (3) فصل الخلايا من midguts من ESG -Gal4،-UAS GFP خط الطيران دون Sytox – وضع هذه المعلمة (الخطوة 4.4.3) يضمن أن جميع الخلايا GFP إيجابية يتم رسم ضمن مؤامرة مبعثر. إذا لم يتم تعيين هذه المعلمات بشكل صحيح، من المرجح أن تحتوي على السكان الخلية فرزها الخلايا الميتة والحطام (الشكل 5B، C)، العديد من الخلايا GFP إيجابية سيفتقد (الشكل 5D) واثنين من القمم متميزة للخلايا GFP إيجابية كما ينظر في المؤامرة الرسم البياني لن يتم الكشف عن (الشكل 2E والشكل 3E). مرة واحدة وقد تم تعيين FACS والمعلمات النابضة، يتم معايرة الصك وعلى استعداد لفرز الخلايا من ESG -GAL4،-UAS GFP خط الطيران. وبما أن هذه المعايير يمكن انقاذه، وكلها المستقبل الفرز جلسات لISCS وEBS من ESG -GAL4، UAS-GFP خط الطيران يمكن أن تبدأ من الخطوة 4.5. وعلى الرغم من اختيار وضع "الطهارة" وأداء نقاء اتجاهين نوع يقلل من عدد الخلايا مرتبة، فإنه يسمح لصرامة فرز أعلى (الخطوة 4.6 و الشكل 4B، C). من المذكرة، والاستفادة من استخدام Sytox بدلا من يوديد propidium لتسمية الخلايا الميتة هي أنه لا يوجد سوى امتداد منخفض في FITC (GFP) القناة، مما يجعل من السهل للتعويض عن غير المباشرة.
لدينا وسيلة لإثراء لISCS وEBS، على التوالي، تقوم على فرز الخلايا وفقا لمختلف المستويات GFP التعبير. ومن المحتمل أن يكون خلال الشيخوخة misdifferentiated EBS أيضا عن GFP على مستوى أدنى، ويمكن أن يكون مخطئا كما ISCS. ومع ذلك، منذ الخلايا مرتبة تختلف أيضا من حيث الحجم وتحبب، فإننا نعتقد أن استراتيجية الفرز لدينا هو الأكثر مناسبة لهذا التاريخ لإثراء لISCS وEBS. أيضا، فمن المعروف أن الخلايا في المعي المتوسط الشيخوخة الاحتفاظ بالهوية ISC لديها نواة صغيرة 15. للحصول على مزيد من الوضوح بشأن هوية الخلايا فرزها، يمكن للمرء أن فرز الخلايا من خط المعدلة وراثيا ذبابة الذي يحمل ESG -GAL4، UAS-GFP والشق يشير مراسل التحوير. منذ وقد تبين الشق أن تكون نشطة فقط في EBS 12،13، معزولة ISCS من المعي المتوسط الشباب ستكون سلبية لمراسل الشق، في حين أن EBS ستكون إيجابية لمراسل الشق. ومع ذلك، أثناء الشيخوخة الشق يشير يصبح الشاذة في النسيج المعى المتوسط. لذلك، لا بد من اختبار ما إذا كان هذا التجريبية انشاء هو في الواقع أكثر موثوقية للتمييز بين ISCS وEBS معزولة من المعي المتوسط القديم.
لقد استخدمنا بالفعل هذا النهج لتحليل مقارن لTranscriptome على ISCS من midguts الصغار والكبار وحددت عددا من العوامل التي يتم تنظيمها بشكل مختلف خلال الشيخوخة (unpub. observ). بالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا الأسلوب لتحليل الاختلافات في التعبير الجيني بين ISCS وEBS. هذا التحقيقالصورة ستوفر نظرة ثاقبة على التغيرات الجزيئية الأولية التي تحدث كما يدخل خلية عملية التمايز. أيضا، فإن العزلة من خلال EBS الشيخوخة واللاحقة التحليلات تسليط الضوء على التغيرات الجزيئية التي يسببها سن misdifferentiation. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة يمكن دمجها مع أدوات الوراثية الأخرى المستخدمة في ذبابة الفاكهة لدراسة وظيفة الجين. وباختصار، هذا الأسلوب يوفر نهج غير متحيز للتحقيق في الخصائص الجزيئية والتغيرات في ISCS وEBS أثناء الشيخوخة. هذا هو أداة قيمة من شأنها أن تسهل استكشاف آليات الشيخوخة في الخلايا الجذعية والسلف الكبار.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Gabriele Allies for excellent technical assistance. We thank the University Ulm Medical Faculty for the use of the FACS Core Facility and the Institut für Molekulare und Zelluläre Anatomie for using the confocal microscope. We thank S. Hayashi for the esg-Gal4, UAS-GFP fly line. This project is funded by the Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Forschungskern SyStaR). A.T. is supported by SFB 1074 (Project A2). A.T. and G.A. are supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, FE578/3-1). H.M.T. is a member of the International Graduate School in Molecular Medicine Ulm (GSC 270).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Forceps: Dumont, Inox Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh) | Sefar | 3A03-0150-102-00 | |
| Falcon 5ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| Polymax 1040 | Heidolph | 543-42210-00 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A4503-50G | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly. |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry | Life Technologies | S34857 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7023 | other solutions, e.g. Trizol can be used for subsequent RNA isolation |
| FACSAria II cell sorter | Becton Dickinson | Turn on one hour prior to sorting |
References
- Jones, D. L., Rando, T. A. Emerging models and paradigms for stem cells ageing. Nat. Cell Biol. 13 (5), 506-512 (2011).
- Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Signer, R. A., Morrison, S. J. Mechanisms that regulate stem cell aging and life span. Cell Stem Cell. 12 (2), 152-165 (2013).
- Iliadi, K. G., Knight, D., Boulianne, G. L. Healthy Aging – Insights from Drosophila. Front. Physiol. 3, 106 (2012).
- Biteau, B., Jasper, H. EGF signaling regulates the proliferation of intestinal stem cells in Drosophila. Development. 138 (6), 1045-1055 (2011).
- Jasper, H., Jones, D. L. Metabolic regulation of stem cell behavior and implications for aging. Cell Metab. 12 (6), 561-565 (2010).
- Biteau, B., Hochmuth, C. E., Jasper, H. Maintaining tissue homeostasis: dynamic control of somatic stem cell activity. Cell Stem Cell. 9 (5), 402-411 (2011).
- Wang, L., Jones, D. L. The effects of aging on stem cell behavior in Drosophila. Exp. Gerontol. 46 (5), 340-344 (2011).
- Lucchetta, E. M., Ohlstein, B. The Drosophila midgut: a model for stem cell driven tissue regeneration. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1 (5), 781-788 (2012).
- Ayyaz, A., Jasper, H. Intestinal inflammation and stem cell homeostasis in aging Drosophila melanogaster. Front. Cell Infect. Microbiol. 3 (98), (2013).
- Jiang, H., Patel, P. H., Kohlmaier, A., Grenley, M. O., McEwen, D. G., Edgar, B. A. Cytokine/Jak/Stat Signaling Mediates Regeneration and Homeostasis in the Drosophila Midgut. Cell. 137 (7), 1343-1355 (2009).
- Ohlstein, B., Spradling, A. The adult Drosophila posterior midgut is maintained by pluripotent stem cells. Nature. 439, 470-474 (2006).
- Micchelli, C. A., Perrimon, N. Evidence that stem cells reside in the adult Drosophila midgut epithelium. Nature. 439, 475-479 (2006).
- Ohlstein, B., Spradling, A. Multipotent Drosophila intestinal stem cells specify daughter cell fates by differential notch signaling. Science. 315 (5814), 988-992 (2007).
- Biteau, B., Hochmuth, C. E., Jasper, H. JNK Activity in Somatic Stem Cells Causes Loss of Tissue Homeostasis in the Aging Drosophila Gut. Cell Stem Cell. 3 (4), 442-455 (2008).
- Choi, N. H., Kim, J. G., Yang, D. J., Kim, Y. S., Yoo, M. A. Age-related changes in Drosophila midgut are associated with PVF2, a PDGF/VEGF-like growth factor. Aging Cell. 7, 318-334 (2008).
- Park, J. S., Kim, Y. S., Yoo, M. A. The role of p38b MAPK in age-related modulation of intestinal stem cell proliferation and differentiation in Drosophila. AGING. 1 (7), 637-651 (2009).
- Berger, C., Harzer, H., Burkard, T. R., Steinmann, J., vander Horst, S., Laurenson, A. S., Novatchkova, M., Reichert, H., Knoblich, J. A. FACS purification and transcriptome analysis of Drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Rep. 2 (2), 407-418 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nat. Protoc. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Yagi, Y., Hayashi, S. Role of the Drosophila EGF receptor in determination of the dorsoventral domains of escargot expression during primary neurogenesis. Genes Cells. 2 (1), 41-53 (1997).
- Amcheslavsky, A., Ito, N., Jiang, J., Ip, Y. T. Tuberous sclerosis complex and Myc coordinate the growth and division of Drosophila intestinal stem cells. J. Cell Biol. 193 (4), 695-710 (2011).
- Dutta, D., Xiang, J., Edgar, B. A. RNA expression profiling from FACS-isolated cells of the Drosophila intestine. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 13 (27), (2013).
