神経筋接合部：測定シナプスサイズ、断片化および共焦点蛍光顕微鏡を用いてシナプスタンパク質の密度の変化
Summary
The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.
Abstract
神経筋接合部（NMJ）は、哺乳動物、運動ニューロンは、自発的な筋収縮を制御を通じて大、コリン作動性シナプスのリレーです。 NMJでの構造変化は、弱さ、萎縮と筋線維の死で、その結果、神経伝達障害が発生することができます。多くの研究は、遺伝子改変または疾患マウスNMJの構造を変化させることができる方法を検討した。残念ながら、それは直接、彼らはしばしば、異なるパラメータおよび分析方法を採用しているため、これらの研究からの知見を比較することは困難であることができる。 3つのプロトコルは、ここで説明されている。最初は、アセチルコリン受容体（AChRの）の面積を測定するために最大値投影共焦点画像を使用して終板とその上のシナプス前神経終末におけるシナプス小胞の染色の領域におけるリッチシナプス後膜ドメイン。第二のプロトコルは、シナプス後膜におけるシナプス蛋白質の免疫染色の相対強度を比較します。第三のPRotocolはエンドプレートでのシナプス後性AChRのパッキングの変化を検出するために蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を使用します。プロトコルが開発され、一連の研究の上に洗練されてきた。品質と結果の一貫性に影響を与える要因を議論すると基準データは健康な若い成体マウスのNMJで提供される。
Introduction
神経筋接合部（NMJ）は、神経系および骨格筋との間の通信を仲介する重要な中継シナプスである。これは、すべての自発的な運動のために必要とされる。蛍光顕微鏡は、長いNMJ 1-3マウスの導入遺伝子の影響を研究するために、またはげっ歯類のNMJ 4-11時の年齢、食事、運動、および疾患の影響を比較するために使用されてきた。このような研究は私たちにNMJの生理学および病態生理学について多くを教えてきましたが、（ 例えば、AChRのエリア、終板面積、周囲長、断片化指数）が報告多様なパラメータは、しばしば、それが難しいこれらの研究の調査結果を比較することにする。前臨床研究者が特に疾患12の齧歯類モデルを用いた研究では、再現性を発揮できるようにするための増加期待があります。ここで説明するプロトコルは、発達生理学的および病態生理学的CHを調査の一連の研究を通して洗練されたNMJにアンジェス。このような研究は、マウスの運動終板と後シナプスの専門分野13-15内のシナプスタンパク質のパッキングの相対密度でシナプスの専門分野の面積の測定を必要とする。
これらの方法の有用性は、重症筋無力症、抗MuSKのマウスモデルにおける最近の研究によって示されている。抗MuSKの陽性重症筋からのIgGの毎日の注射は成体マウスに、患者は彼らが2週間以内に16弱になった原因無力。 （神経端末で）シナプトフィジンのための二重標識された筋肉切片の共焦点最大投影画像とシナプス後性AChRは、一次変化としてのAChR染色の分野で進行性の低下を明らかにした。重要なことには減少率は、同等のシナプス電位の振幅の減少、シナプス伝達の障害及び筋衰弱17,18を説明するのに十分であった。定性的に類似の所見は他の研究グループにより報告された10,19。同じNMJ測定方法ので、このマウスモデル20,21に無力抗MuSKの重症筋を治療するための3種の薬物の影響を評価するために使用されている。
座りがちな高齢化は、神経筋の接続の損失につながることができます。マウスは古い時代に進行としてここに記載されているプロトコルは、モータのエンドプレートでの神経終末シナプトフィジンのエリアの加齢に伴う減少を明らかにした。同じ方法は、自発的な運動は、主に他のグループ4による以前の研究と一致して、シナプス前神経末端領域22の低下を防ぐことができることを明らかにした。神経接続の損失はまた、筋萎縮性側索硬化症9,23のSOD1G93Aマウスモデルにおいて発生する。
上記の研究では、健康状態の様々なNMJでの前または後シナプスの専門分野のいずれかの面積の削減につながる可能性があることを示している。これは損なわれ、シナプス楽しいことがありctionまたは神経筋の接続の完全な喪失を告げることがあります。 3つのプロトコルは、シナプスの専門分野の面積と密度の定量化を可能にすることが記載されている。第一のプロトコルの目的は、蛍光顕微鏡を用いて、シナプス前および後の専門および哺乳類のNMJでのその配列の領域の実用的かつ再現可能な測定を提供することにある。二次元の最大投影共焦点画像およびNIH ImageJを用いて画像解析をシナプトフィジン染色（シナプス小胞）、シナプス後性AChRおよびシナプス重なり領域の面積の変化を検出するために使用される。シナプスの専門分野を識別するために使用される視覚情報が最大となるように共焦点撮像パラメータ（ゲイン、オフセット·レベル）は、各NMJのために最適化される。神経筋障害はまた、シナプス後のAChRおよび/または他のシナプスタンパク質の密度の変化に起因することができます。第二のプロトコルは、シナプス後のタンパク質の相対密度の変化を検出するために適用することができるムスク、rapsyn、ジストログリカン、リン酸化されたSrcキナーゼおよびリン酸化のAChR 18,21-として。
重症筋無力症では、シナプス後膜内のAChRの減少密度は、シナプス障害や筋力低下の直接の原因である。第三のプロトコルは、シナプス後膜14,15内の隣接性AChRの近接性の変化を評価するための蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）法が記載されている。この方法は、蛍光αブンガロトキシン（BGT）で標識された隣接性AChRの間のエネルギー移動を検出する。 FRETは、蛍光ドナーとアクセプタープローブが離れて10nm未満である場合にのみ発生します。これは、直接シナプス電位の振幅に関連することができるのAChRパッキングの気密性で（超顕微鏡）の変化を明らかにすることができます。
過去10年間で洗練されたこれらの3つのプロトコルは、一貫して再現可能な方法で、NMJ整合性の補完的な対策を提供する。標準化されたプロトコルを使用してA番目のパラメータは、哺乳類のNMJの際の遺伝子と環境介入の効果の比較を容易にするはずである。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するプロトコルは、確実に測定し、正常な老化と疾病状態を含む条件の範囲にわたって、NMJの特性の変化を定量化するために私たちを有効にしている。顔NMJ画像専用のために記載された方法は、研究者が前と後シナプスの専門分野の面積とシナプス重なり/位置合わせの面積を比較することができるようになります。前およびシナプス後のタンパク質の相対的強度を比較するために…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Health and Medical Research Council [570930]. Imaging was carried out at the Bosch Institute Advanced Microscopy Facility. Former members of the lab, whose work is cited, are thanked for their contributions to developing these methods.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Scanning confocal microscope | Leica | DM IRE2 with TCS SP2 system | Most scanning confocal microscopes should be suitable. |
| Zeiss | LSM 510 Meta | ||
| Leica | SPE-II | ||
| Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT) | Life technologies | B35451 | Used for labelling AChRs |
| Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT) | Life technologies | B35450 | Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece |
| rabbit anti-synaptophysin | Life technologies | 18-0130 | Different batches of primary antibody differ in effective working dilution |
| FITC-anti-rapsyn mab1234 | Milipore | FCMAB134F | Monoclonal antibody conjugated to FITC |
| FITC-donkey anti-rabbit IgG | Jackson | 711-095-152 | Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch |
| Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.) | ProSciTech | IA018 | Cryostat embedding matrix for freezing muscles |
| DABCO | Sigma | 10981 | Mounting medium that slows photobleaching of fluorophors |
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