亜麻の花-DIP変換（<em>アマ</em>）高転換率のトランスジェニック子孫を生成するために、

1.植物を育て 6週間前浸漬し、土壌と5インチポットを記入し、亜麻の種子をまく¼（ポット当たり4の種子）、土壌に深くインチ。シードの上に土を固めるようにしてください。定期的に植物に水と長い昼光（14時間の明と10時間の暗闇）でそれらを維持する。 主要な花序（花「臓器のクラスター）を定期的に植物を確認してください。芽が表示され、ちょうど花序（ 図1及び2）に形成されたときに植物が形質転換のための準備ができている。必要に応じて、芽を確認するには、その周りの葉をカット。 注：最高の花のステージを使用することが重要であると考察に詳述されている。 それはサイドbrachesより多くの花を生産するように実験的治療のための植物の主な枝を使用してください。コントロールとして（浸漬されるものではない）、または他の実験治療のためにどちらかの側枝を使用してください。 また、メインとサイド枝を使用実験的治療のために同じ植物とコントロールとして、または他の実験的な治療のために別の植物を使用しています。個々の支店と日付と治療の種類と個々の花をマークするラベルを使用してください。 2.クローニングおよび形質転換大腸菌（E. coli）細胞の中 T-DNAを保有植物バイナリーベクターのマルチクローニングサイトに目的の断片/遺伝子をクローニング。 1段階または2段階でクローニングを実行します。 直接植物バイナリーベクターには、このプロトコル（〜500 bp）の中に小さなインサートのクローンを作成する。このプロトコルでは、植物バイナリーベクター（PRI909）を使用します。それ以外の場合は、同様の戦略で、他の植物バイナリーベクターを使用しています。 最初の植物バイナリーベクターにサブクローニングその後、（特定の植物ではない）一般商業クローニングキットを使用して：あるいは、二段階で大きな挿入（≥6.5KB）をクローンする。 PCR REACを設定ンは、目的の遺伝子を増幅した。 （使用中の植物バイナリーベクターのマルチクローニングサイトによれば）5 '末端に制限部位を有するプライマーを設計します。 以下のサイクリング条件で、標準的なPCRは、ゲノム亜麻DNAを使用して行う：24℃の初期保持し、その後、5秒間98℃の30サイクル、続いて94℃で2分間、15秒間60℃、および2分間72℃である。 4℃で無期限保留に続く5分間の72℃での最終伸長工程を実行します。 1％トリス/ホウ酸塩/ EDTA（TBE）アガロースゲル上の別々のPCR産物は、1時間、100Vでゲルを実行する。ゲルから製品を浄化し、ナノドロップを経由して定量化する。 商業クローニングベクターにPCR産物をクローニングする連結ミックスを設定します。製造業者のプロトコルに従ってください。 化学的にコンピテントに連結ミックスを変換する次のように大腸菌細胞 。 CHの1バイアルにライゲーションミックス2μlのを追加します。emicallyテントE. coli細胞 。氷上で30分間インキュベートする。 熱は、42℃で30秒間細胞に衝撃を与える（熱ショック時間および温度は、使用する細胞の種類に依存する）。 氷上でインキュベートし、カタボライト抑制（SOC）培地でRTスーパー最適ブロス250μlを添加する。 チューブをキャップと1時間、37℃で200rpmでオービタルシェーカーでインキュベートする。 10広がる – （37℃で予め温め）予め温めたLBプレート+適切な選択抗生物質の各形質転換からの50μlを（使用される市販のクローニングベクターの種類に基づいて、選択抗生物質を決定する）。 37℃CO / Nでプレートをインキュベートする。 市販のキットを使用して、ミニプレッププラスミド精製のために〜10個のコロニーを選択してください。ミニプレッププラスミド精製は、一般的に以下のように行われる。 注：バッファ名が使用される市販のキットに固有のものですが、その一般的な機能は似ています。 2の単一のコロニーを接種- （使用した市販のベクターのタイプに基づいて決定される）適切な選択的抗生物質を含む5mlのLB培地。 激しく振盪（〜300 rpm）で、37℃で約8時間インキュベートする。 10分間6000×gでの遠心分離によって細胞を回収。 250μlの再懸濁緩衝液にペレットを再懸濁。ミックスと渦は完全にペレットを分散させる。 6回 – 溶解バッファー250μlのを追加して、細菌細胞を溶解は、チューブ4を反転させることによって完全に混合。 中和緩衝液中に溶解液を中和し、4反転 – 混合する6回。卓上型マイクロ遠心上〜17,900×gで10分間遠心。 スピンカラムに前のステップからの上清を転送します。 60秒 – 30〜17,900×gで再び遠心し。 60秒 – 30 0.75ミリリットル洗浄緩衝液と遠心を追加することによって、スピンカラムを洗浄します。フロースルーを捨てます。 レモへの追加1分間遠心残留洗浄バッファーVEの。新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブにスピンカラムを配置します。 DNAを溶出するために、各列の中央に50μlの水を加える。 1分間放置しましょう​​、と1分間遠心する。 3.インサートの存在のために精製されたプラスミドを分析制限消化： インサートをクローニングするために使用される制限酵素でプラスミドを消化してインサートの存在を決定するために制限消化を設定する。次のように典型的な二重制限して反応をダイジェスト：精製プラスミド1μgの、それぞれの制限酵素の1μL、2μLの10倍の制限は、緩衝液+ 2μlのBSA（該当する場合）、（20μLの合計）Xμlの水を消化穏やかに混合し、推奨温度（1酵素から別異なります）でインキュベート。 制限を1時間、100Vで実行、1％TBEアガロースゲル上で反応を消化し、適切な大きさのドロップアウトを探して分析する。 PCR分析。 INSERTまたはベクトルとインサートとの間の接合部の内側に増幅するために市販のベクター領域からプライマーを用いて、精製したプラスミドを用いてPCRを設定します。共通プライマーは、M13のフォワードおよびリバース及びT3 / T7プライマーである。 このプロトコルでは、以下のPCRサイクル条件を使用し、その後、5秒、15秒、60℃、98℃で18サイクル、続いて94℃で2分間、および72℃、24℃の初期保持する2分間。 4℃で無期限保留に続く5分間の72℃での最終伸長工程を実行します。 1％TBEアガロースゲル上に負荷PCR産物と100して実行 – 1時間、120 V。 シーケンシング： 分析し、インサートの存在を確認するために、市販のシークエンシング施設に精製したプラスミドを送信します。 正しい構築物が得られたら、（植物バイナリーベクターに）クローニングの第二段階のためにそれを使用。 注： – 3.3 2.3〜ステップクローニングは、一段階で完了している場合を排除することができる。 植物バイナリーベクター（PRI909）とE.へのクローニング4. 大腸菌の形質転換二重制限を設定する植物バイナリーベクターを線状化し、プライマー（ ステップ2.2）に添加し、同じ制限酵素部位を使用して、以前にクローニングされた挿入物を単離するための反応を消化する。 2時間 – 制限1、100 Vで動作し、ゲル電気泳動を用いて消化し、分析。ゲルからの挿入および線形化された植物バイナリーベクターをカット。 ゲル製品を精製する市販のキットを使用してください。メーカーのマニュアルを参照してください。 植物バイナリーベクターへの挿入を連結する連結反応を設定します。ベクトル比インサートは、インサートのサイズや植物バイナリーベクターに依存します。このプロトコルではLIS1インサートは6.5キロバイトだったと植物バイナリーベクターは、9 KBでした。ベクトル比2のインサート：したがって、1を使用。 <li細菌形質転換、プラスミド精製および分析のための3 – >を繰り返して、2.4を繰り返します 。正しい構築物は（+植物バイナリーベクターを挿入）が得られると、 ステップ5でエレクトロポレーションに進みます。 アグロバクテリウムへ5.エレクトロポレーションは、電気的にコンピテント細胞ツメファシエンス アグロバクテリウムのバイアルを解凍すると、氷の上に電気的にコンピテント細胞ツメファシエンス 。 氷の上に、コンピテントセルの20μlにバイナリーベクタープラスミドDNAを1 ngのを追加し、穏やかに混合する。 氷の上0.1cmエレクトロポレーションキュベットを冷却。 エレクトロポレーションキュベットにテントセル/ DNAミックスを移し、下部の混合物を収集するためにタップします。エレクトロ機やパルスでキュベットを入れて（電圧と時間の条件は、キュベットのサイズと使用エレクトロに依存）。 15mlチューブにSOC培地および転送細胞を1ml加える。 28から30で1時間インキュベートする100 rpmで振とう、℃。プレート50 – LB寒天+適切な選択抗生物質に対する細胞100μl（植物バイナリープラスミドと使用アグロバクテリウムの菌株に依存し、50μg/ mlのカナマイシンおよび100μg/ mlストレプトマイシン、このプロトコルの使用では。）。 30°C – 28で48時間までのプレートをインキュベートします。 コロニーの選択とプラスミド精製の ​​ための手順を繰り返し2.5。 手順3を繰り返して、プラスミドを分析し、フローラル·ディッピング用構 ​​築物を用いて前に挿入し、T-DNAの整合性をチェックする。 ステップ3.3のように、全体のインサート地域全体とT-DNA領域を横断し、配列決定することにより、複数のPCRプライマーを用いて手順を繰り返し3.2、。 注：このプロトコルでは、4つの異なるプライマーは、T-DNAとインサート全体で10のプライマー間で設計されました。 iを選択したアグロバクテリウムコロニー植物バイナリープラスミドの存在が確認されると、場所細胞-80℃でnは、50％グリセロール、店舗。彼らは一週間7内で使用される場合、ストアは、4℃でプレート上にコロニーを残り。 6.花ディップ注：-ディッピング花の前に2日： 液体培地中でLB +適切な抗生物質に- （許容さ1〜0.5の間でOD 600）の固定相へのアグロバクテリウム細胞を成長させる。 注：これらの植物バイナリーベクター、使用アグロバクテリウム株の種類に基づいて、 工程5.6と同様の抗生物質である。 1で培養を開始：飽和（5ミリリットル）O / N培養の100希釈液と24育つ – 150 rpmで振とうしながら28〜30℃で48時間。文化はmidlogarithmic相に達している必要があり、より多くの可能性に近づいまたは固定相1になります。約0.8のOD（0.5〜1の間で再びODはすべて可）8。 5000 xで遠心分離して細胞を回収RTでグラム。 浸潤培地中の細胞（ – 0.003％のSilwet L-77 5.0％スクロース+ 0.05）を懸濁する。浸漬の最初のラウンドでは、0.05％のシルウェット-77を使用しています。 2回目および3回目のために、（ 議論で詳述）0.03％の濃度を低下させる。 フローラルディップ工程に進みます。その側に工場を置き、1〜2分間浸透媒体にしか見え芽を浸す。その側に工場を残し、ドーム（ 図3）で高湿度を維持するために、プラスチック製のラップでそれをカバーしています。 翌日、直立位置に植物を配置し、正常に維持する。 芽が（通常、約10の後に- 14日）大きくなるときは- 6.4、繰り返しは6.1を繰り返します 。 0.003％に60秒とシルウェット-77濃度 – 30に浸漬時間を削減します。 彼らの種子が成熟したとします（ 図4）収集することができるの準備が整うまで、通常は植物を維持する。 ポジティブトラの7の選択直接PCRでnsformants ステップ1.1のように土壌上のT1種子をまく。 代替的に、水500ml中の寒天のMS培地+ 4グラムを2.2g添加することにより、MurashigeおよびSkoogの基礎塩培地（MS培地）を作る。オートクレーブ小さな植木鉢に注ぐ。使用するまで4℃で保管してください。 固化したMS培地上に置いて、種子をまく。長い日光（14時間の明と暗の10時間）の下で保管してください。 6日目（ 図5） -種子は、約4で発芽する。 出発点として、それぞれの花から1シードを使用してください。陽性形質転換体が得られない場合には、花から別のシードを選ぶことによって、この手順を繰り返します。 注：いくつかのケースでは1花からではないすべての種子が変換されますので、同じ花から別の種をテストします。実験的な花から追加の種を選択すると、必要な場合がある。 定期的に苗に確認してください。約10では – 発芽後14日間、とき真葉は、開発し、直接PCRで植物をテストします。 3葉 – 2切断することにより、葉のDNA抽出物を準備 – 各苗から（5〜10 mg）をし、マイクロ遠心チューブに配置します。 各チューブに50 mMのNaOHを180μl添加し、そして95℃で10分間インキュベートする。 1 Mトリス-HCl（pH8.0）を20μl添加することにより抽出物を中和する。 陽性形質転換体を選択するために、T-DNAまたは挿入します（ 図7）間で設計されたプライマーを用いて、直接PCR反応において抽出物の1μLを使用してください。 このプロトコルでは、24°Cの初期保持と直接PCRを使用し、その後、10秒、15秒、アニーリング工程、及び68℃での伸長工程98℃（40サイクル、続いて98℃で2分C）。 4℃で無期限保留に続く5分間の68℃での最終伸長工程を実行します。 （サイクルのためのプライマー、アニーリング温度および伸長時間の詳細については、表1を参照してください）。 陽性形質転換体を特定し、成熟にそれらを育てる。種子はMS培地、大きな鍋で土壌に移植（ 図5）で発芽させた場合。