Хирургический метод Виралли опосредованной доставки генов к мыши внутреннего уха через круглое окно мембраны

Генная терапия уже давно было предложено в качестве потенциального лечения для генетического потери слуха, но успех в этой области остается неуловимым ^1. На сегодняшний день, вирусно опосредованные методики преобладали из-за теоретической возможности ориентироваться на конкретные типы клеток в относительно недоступном улитки. Оба аденовируса (AV) и аденоассоциированный вирус (AAV) были использованы для доставки генов кохлеарного. AAVs имеют то преимущество, улитки для целого ряда причин. Они репликации с дефицитом вирусы и могут эффективно передавать трансгенных молекулы различных типов клеток, включая нейроны, важной мишенью для ряда причин потери слуха. Запись AAV в клетке опосредованы специфическими рецепторами ^2; Таким образом, выбор конкретного серотипа должны быть совместимы с типами клеток, чтобы быть трансдуцированных. AAVs может эффективно трансфекции клетки волос ^3, и включить в геном хозяина, в результате чего в стабильном, долгосрочном выражения траnsgenic белка и фенотипическая изменение в клетке ^4. Хотя это и не обязательно выгодно для краткосрочного применения, таких как регенерация волос клеток, долговременные выражение очень важно для стабильной спасения генетических дефектов. Потому что AAVs не связаны с какой-либо человеческой болезни или инфекции и не демонстрируют ототоксичность ^5,6,7, они являются идеальным кандидатом для использования в генной терапии для унаследованных форм потери ⁸ слуха.

Передача экзогенного генетического материала в млекопитающих внутреннее ухо с помощью вирусных векторов изучалась на протяжении последнего десятилетия, и становится перспективным методом лечения и генетических и приобретенных форм потери ⁹ слуха. Улитка потенциально идеальной мишенью для генной терапии по нескольким причинам: 1) его небольшой объем требует ограниченное количество вируса необходимо; 2) его относительная изоляция от других ограничений системы органов побочных эффектов; и 3) его заполненные жидкостью камеры облегчить вируснойдоставка по всей лабиринта ^{10, 11,12,13,14, 15.}

Мышиные модели врожденной глухоты позволяют использовать многие методы исследования, чтобы следить за развитием внутреннего уха в систематическом, воспроизводимого образом. В то время как небольшой размер мыши cochleae действительно представляет некоторые хирургические трудности, мышь служит чрезвычайно важной моделью в изучении генетического потери слуха, с нескольких экспериментальных преимуществ по сравнению с другими видами ^16. Мышиные модели позволяют оценить диапазоне характеристик с помощью генной анализа сцепления, сбор подробных морфологических наблюдений, и, имитирующей патогенные сценарии; как таковые, они являются хорошими кандидатами для вирусно опосредованного генной терапии. Обширные генетические исследования на мышах в сочетании с технологическими достижениями сделали возможным для создания генетически модифицированных мышей в воспроизводимым образом между лабораториями ^{17,18, 19, 20,21.} Furthermorе, существует множество моделей как для приобрел и унаследовал слуха фенотипы потери у мышей, что позволяет тщательное тестирование в этом животной модели ^{22, 23,24.} Таким образом, исправление слух с помощью вирусно-опосредованного генной терапии в мышиной модели является целесообразным первым шагом в поисках лекарства от болезни человека.

Ранее мы показали, что трансгенные мыши, лишенные везикулярного глутамата транспортер 3 (VGLUT3) рождаются глухими из-за отсутствия высвобождения глутамата в IHC ленте Synapse ^25. Поскольку эта мутация не приводит к первичной дегенерации волосковых клеток, эти мутантные мыши являются потенциально отличный модель, в которой для проверки кохлеарный генной терапии для врожденной потерей слуха.

На сегодняшний день количество вирусных методов доставки для генной терапии кохлеарный были описаны, в том числе круглого окна мембраны диффузии, круглый инъекции окно мембраны и доставки через cochleostomy. Есть мощныйМВЛ преимущества и недостатки каждого из этих подходов ^9.

Мы сообщаем хирургический метод вирусом опосредованной доставки генов во внутреннее ухо VGLUT3 КО мышей через мембрану круглого окна (РВМ). После ушной метод РВМ инъекции минимально инвазивной с превосходной сохранности слуха, и относительно быстро. Как мы уже ранее опубликованы, в попытке восстановить слух в этой модели мыши, вектор AAV1, несущий ген VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) была введена в улитку этих глухих мышей в постнатальный день 12 (P @), в результате чего восстановление слуха ^26. Услышав у мышей VGLUT3 KO была проверена слухового ответа ствола мозга (ABR), в то время как трансгенная экспрессия белка была проверена с помощью иммунофлюоресценции (ИФ). Таким образом, это методология показывает, что вирусно-опосредованного генной терапии может исправить генетический дефект, который бы в противном случае приводит к глухоте.