PeakForce定量的ナノメカニカルプロパティマッピングを使用した赤色光光受容体の原子間力顕微鏡
Summary
A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.
Abstract
原子間力顕微鏡（AFM）は、表面の力応答を調べるために、カンチレバーに取り付けられたピラミッド型チップを使用しています。先端部の偏向は、画像地形に変換することができるレーザ及びセクタ化検出器での10〜pNで測定することができる。振幅変調または「タッピングモード」AFM画像を生成するためにその共振周波数で振動させながら表面に断続的に接触するプローブを含む。流体セルと組み合わせて使用し、タッピングモードAFMは、そのような生理学的に関連する条件の中のタンパク質などの生体高分子のイメージングを可能にします。タッピングモードAFMは、プローブと経験の浅いユーザーのために挑戦することができ、スキャンパラメータの多数の頻繁な調整を手動でチューニングする必要があります。高品質な画像を得るために、これらの調整は最も時間を消費である。
PeakForce定量的ナノメカニカルプロパティのマッピング（PF-QNM）は力responを測定することにより、画像を生成する試料との接触のすべてのポイントのためにそれ自体の曲線。 ScanAsystソフトウェアでは、PF-QNMを自動化することができる。このソフトウェアは、与えられたサンプルに対して自動的に設定点、駆動周波数、スキャン速度、ゲイン、およびその他の重要なスキャンパラメータを調整する。のみならず、このプロセスは壊れやすいプローブおよびサンプルの両方を保護しない、それは非常に高い解像度の画像を得るのに必要な時間を減少させる。 PF-QNMは、流体中のAFMイメージングのための互換性があります。したがって、それは生物学的に関連する材料を画像化するための広範な用途を有する。
本論文で提示した方法は、光合成Rから、細菌の赤色光感光体RpBphP3（P3）の画像を得るため、PF-QNMのアプリケーションについて説明しその明順応状態にあるオオウズラタケ 。この方法を使用して、個別のタンパク質P3の二量体および二量体の凝集体は、イメージング緩衝液の存在下で雲母表面上に観察されている。適切な表面の調整及び/又は溶液の濃度は、この方法に一般に、他の生物学的に関連する高分子および軟質材料に適用することができる。
Introduction
原子間力顕微鏡（AFM）は、1986年の発明（ 図1）ので、表面、薄膜、単分子の構造的および機械的特性を調査するために非常に重要なツールとなっている。1-3液晶セルを使用して、方法が有している生体高分子の研究や生理学的に関連する環境下であっても、生きている細胞で特に有効になる。非接触モードAFMによる一般的に不適切であることから4-10タッピングモードAFMは、伝統的に、表面に軟質材料または緩く結合した分子を画像化するために使用されている横方向の力による被害にカンチレバーことにより、試料に加わる。11タッピング·モードAFMは、実質的に先端が断続的に表面に触れたのではなく、一定の接触することによってこれらの力を低減します。このモードでは、カンチレバーが表面に垂直なその共振周波数で又はその付近で振動される。同様に、AFMモードに連絡することを、トポグラフィーは肛門ですのxy（距離）の関数としてのzピエゾの動きをプロットすることによってyzed。
カンチレバーダイナミクスは時や共振の近くで非常に不安定になることができます。従って、それらは、「定常状態」状況の外側を自動化することは非常に挑戦的である。具体的には、これらのダイナミクスは、サンプルの特性および走査環境の両方に依存します。 （より）硬い表面に吸着柔らかい分子の場合、分子に適切にチューニングされたフィードバック·ループは、表面のための帰還発振につながる可能性があります。さらに流体中の動作は、カンチレバーのチューニングが複雑になる。温度の変化又は流体レベルが一定の設定点の再調整、ゲイン、および他の撮像パラメータを必要とする。これらの調整は非常に時間がかかり、ユーザにとって困難である傾向がある。
ピークフォース定量的ナノメカニカルプロパティのマッピング（PF-QNM）は、タッピングモードAFMのように、断続的にサンプル（ 図2）と接触させることにより横方向の相互作用を避けることができます。12-15 </ SUP>しかし、PF-QNMは、非共振モードとタッピングモードAFMよりもはるかに低い周波数で動作します。これは、タッピングモードAFM、流体の存在によって悪化特にチューニングの課題を排除します。 PF-QNMで、画像は、接点の全ての点において力応答曲線を取ることによって収集される。 ScanAsystソフトウェアの追加により、スキャンパラメータの15調整が自動化することができ、高解像度の画像であっても、経験の浅いユーザーがほんの数分で得られる。ユーザはAFMに慣れになると、自動化されたパラメータのいずれかまたは全てが、画像品質を手動で微調整するために実験者を許可し、いつでも無効にすることができる。創業以来、PF-QNMは。分子下レベルでのバクテリオロドプシン、膜タンパク質、および他の天然タンパク質をマッピングするために適用されたバクテリオロドプシンのために16-18、タンパク質の柔軟性とX線結晶構造の間の直接的な相関関係があります。12 PF -qnMは、高解像度の生細胞を研究するために利用されている。19,20さらに、PF-QNMデータは、細胞の整合性と機能に重要である赤血球膜内の構造と力学の間の重要な接続を明らかにしています。21
私たちは、22 bacteriophytochromes（BphPs）と呼ばれる赤色光の光受容体の構造を調べるためにAFM、23を含む、走査型プローブ顕微鏡（SPM）の方法を使用している。24,25彼らが共有シグナリングエフェクターモジュールなどにに連結された光検出モジュールから構成されヒスチジンキナーゼ（HK）として。26光センシングモジュールは、一般的に構造変化のシグナル伝達エフェクターモジュールに達し、全体のタンパク質の全体的な変革につながる一連の光子を吸収すると構造変化を受け、ビリン発色団が含まれていますこの変換に基づく24,27-29、二つの異なる光吸収のあるBphPs、赤と遠赤色光吸収状態のtatesは、Pr及びPfrのと表記。 PrはほとんどBphPsため、熱的に安定な、暗順応状態である。のPr /のPfR光変換の分子基盤は完全に起因するこれらのタンパク質の限定された構造の知識に理解されていない28。 Dから一つの構造を除いてデュランスは 、これらのタンパク質の30すべての公開X線結晶構造は、暗順応状態にあり、エフェクタードメインを欠いている。無傷BphPs効果的核磁気共鳴（NMR）によって研究することが大きすぎると、X線結晶学のために（特に、明順応状態で）、その完全な形で結晶化することが困難なことで有名である。 BphPsは最近、赤外蛍光タンパク質マーカー（IFPの）ように操作されている。これらのタンパク質の31構造解析が有効IFP設計で支援を促進することができます。32-36
この記事の焦点は、手順を提示することであるPF-QNMを介して液体セルAFMを用いBphPsの撮影。この方法は、光合成細菌RからbacteriophytochromeのRpBphP3（P3）の明順応状態の研究によって証明されるオオウズラタケ 。ここに提示AFM手順は、タンパク質の画像化のための便利で簡単な方法、ならびに他の生物学的巨大分子である。この方法では、個別の分子の構造の詳細は、上位理系実験セッションのような短時間で収集することができる。断面積を測定し、さらに次元解析を完了を通して、実験データは、有用な計算モデルと比較することができる。37-42
Protocol
Representative Results
Discussion
AFMは、生理学的に関連する条件下でタンパク質および他の生物学的巨大分子を画像化する十分な能力、走査型プローブ顕微鏡法である。 X線結晶学およびNMRと比較して、AFMの一つの制限は、同じ解像度、特に横方向の解像度を達成することができないことである。任意の表面上の分子を分析するためにAFMを使用する場合、データが分析されるとき、分子の画像上表面とプローブの影響も考慮?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NSF-MRIプログラム（CHE：1229103）新しい制御電子機器、ソフトウェア、液体セル、およびデュアルAFM / STMを組み立てるために必要な他の機器の購入資金を提供するために認められている。私たちは、AFM計測機器、トレーニング、およびイメージングの支援のためにシカゴ大学のNSF-MRSECプログラム（DMR-0820054）で共用設備を認識し、機器の時間のための材料研究施設ネットワーク（DMR-0820054）によって使用可能になった。私たちは、特に私たちのキャンパスに必要な器具類をもたらしたNSF-MRI提案の資金調達の前に生徒たちを歓迎するために博士Qiti郭博士ジャスティンJureller、教授のKa·イー·リーに感謝します。学生や教職員だけでなく、消耗品のためのサポートのための夏の研究奨学金を提供したノースイースタンイリノイ大学に授与：私たちは、タイトルIII STEM補助金（P031C110157 ID）から資金提供を認める。最後に、継続的なインストゥルメンタルサポートのためにとrに許可をブルカー·ナノ·インクを認めるPeakForce QNMのメカニズムを示すプロットをeproduceと自動化されたソフトウェアを記述するために単語ScanAsystを使用する。
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
| NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
| MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| Multimode 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipped with Nanoscope V controller and J scanner |
| Probe | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
| Tapping Mode Fluid Cell | Bruker-Nano | MTFML | |
| Mica V-4 Grade | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
| Sample support disk | nanoSurf | BT02236 | |
| Petri dish | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| micropipettors | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | Prepared according to cited references | ||
| Nanoscope software | Bruker-Nano | ||
| Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
| Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
| 1 ml syringe | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf tubes | Denville Scientific | C2171 | |
| The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |
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