מיקרוסקופית כוח האטומי של אורות אדומים קולטני אור שימוש במיפוי PeakForce כמותי nanomechanical נכס
Summary
A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.
Abstract
מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) משתמש בקצה פירמידה צמוד לשלוחה כדי לחקור את תגובת הכוח של פני השטח. הסטיות של הקצה ניתן למדוד ל~ 10 PN על ידי לייזר וגלאים סקטוריאלית, הניתן להמרה לטופוגרפית תמונה. אפנון משרעת או AFM "מצב קשה" כרוך הבדיקה ביצירת קשר רציפה עם פני השטח בעת נדנוד בתדר התהודה שלה כדי לייצר תמונה. הפועל בשיתוף עם תא נוזל, הקשה מצב AFM מאפשר ההדמיה של מקרומולקולות ביולוגיות כגון חלבונים בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. הקשה במצב AFM דורש כוונון ידני של הבדיקה והתאמות תכופות של מספר רב של פרמטרים סריקה שיכולה להיות מאתגר עבור משתמשים לא מנוסים. כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה, התאמות אלה הן לצרוך הזמן ביותר.
PeakForce כמותי nanomechanical נכס המיפוי (PF-QNM) מייצר תמונה על ידי מדידת respon כוחעקומת se לכל נקודת מגע עם המדגם. עם תוכנת ScanAsyst, יכול להיות אוטומטי PF-QNM. תוכנה זו מתאימה את תדירות כונן הגדרת נקודה,, קצב סריקה, רווחים, ופרמטרי סריקה חשובים אחרים באופן אוטומטי למדגם נתון. לא רק שתהליך זה להגן על שני בדיקות ודגימות שבירות, זה מפחית באופן משמעותי את הזמן הנדרש כדי להשיג תמונות ברזולוציה גבוהות. PF-QNM תואם להדמית AFM בנוזל; לכן, יש לה יישום נרחב הדמיה חומרים רלוונטיים מבחינה ביולוגית.
השיטה המוצגת במאמר זה מתארת את היישום של PF-QNM כדי להשיג תמונות של קולטי אור אורות אדומים בקטריאלי, RpBphP3 (P3), מר 'הפוטוסינתזה palustris במדינה מותאם האור שלה. באמצעות שיטה זו, הדימרים בודדים חלבון של P3 ואגרגטים של הדימרים נצפו על משטח נציץ בנוכחות חיץ הדמיה. עם התאמות מתאימות למשטח ו / או ריכוז פתרון, שיטה זועשוי בדרך כלל להיות מיושם על מקרומולקולות הרלוונטית מבחינה ביולוגית אחרת וחומרים רכים.
Introduction
מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הפך לכלי חשוב מאוד עבור חוקר את התכונות המבניות ומכאניות של משטחים, דקים סרטים, ומולקולות בודדות מאז המצאתו בשנת 1986 (איור 1). 1-3 שימוש בנוזל תא, יש לו את השיטה להיות שימושי במיוחד במחקרים של מקרומולקולות ביולוגיות ותאים גם חיים בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. 4-10 מצב הקשה AFM באופן מסורתי משמש להדמית חומרים רכים או מולקולות קשורות באופן רופף למשטח, מאז AFM קשר מצב הוא בדרך כלל לא מתאים בשל לנזק שנגרם על ידי הכוחות לרוחב המופעל על המדגם על ידי שלוחה. 11 AFM טאפינג מצב מפחית באופן משמעותי את הכוחות האלה על ידי כך את הקצה לסירוגין לגעת במשטח ולא להיות בקשר הרציף. במצב זה, השלוחה נעה ליד או תדר התהודה שלה רגיל אל פני השטח. באופן דומה ליצור קשר עם מצב AFM, טופוגרפיה היא אנאליyzed על ידי התוויית התנועה של z-piezo כפונקציה של XY (מרחק).
דינמיקת שלוחה יכולה להיות די יציבה ליד או תהודה; לכן, הם מאוד מאתגרים כדי להפוך מחוץ למצב "מצב יציב". באופן ספציפי, דינמיקה אלה תלויים בשני מאפייני המדגם וסביבת סריקה. למולקולה רכה שנספחה למשטח קשה (ER), לולאת משוב מכוונת היטב למולקולה עשויה להוביל לתנודת משוב למשטח. מבצע בנוזל מסבך עוד יותר את הכוונון של שלוחה. שינויים ברמות טמפרטורה או הנוזל דורשים הסתגלות מתמדת של נקודת סט, רווחים, ופרמטרי הדמיה אחרים. התאמות אלו נוטות להיות זמן רב ומאתגר עבור משתמשים מאוד.
שיא הכוח כמותי nanomechanical נכס מיפוי (PF-QNM), כמו ההקשה AFM מצב, נמנע מאינטראקציות לרוחב על ידי לסירוגין פנייה המדגם (איור 2). 12-15 </ Sup> עם זאת, PF-QNM פועל במצב ותדרים נמוכים בהרבה מAFM הקשה במצב שאינו מהדהדים. זו מבטלת את אתגרי הכוונון של הקשה במצב AFM, במיוחד אלה החריפו על ידי הנוכחות של נוזל. עם PF-QNM, תמונות נאספות על ידי לקיחת עקומת כוח תגובה בכל נקודת המגע. עם התוספת של תוכנת ScanAsyst, 15 התאמה של הפרמטרים הסריקה יכולה להיות אוטומטית ותמונה ברזולוציה גבוהה שהושגה בעניין של דקות על ידי אפילו משתמשים לא מנוסים. ברגע שהמשתמש הופך להיות מוכר יותר עם AFM, את כל הפרמטרים האוטומטיים או כל עשוי להתבטל בכל עת שמתירה בניסויים כדי לכוונן את איכות התמונה באופן ידני. מאז הקמתה, PF-QNM הוחל על מפת bacteriorhodopsin, חלבון קרום, וחלבוני ילידים אחרים ברמת submolecular. 16-18 לbacteriorhodopsin, קיים מתאם ישיר בין גמישות החלבון ורנטגן מבנים קריסטלוגרפיים. PF 12 -QNM נוצל כדי לחקור תאי חיים עם רזולוציה גבוהה. 19,20 קשרים חשובים יתר על כן, נתוני PF-QNM יש הובהרו בין המבנה ומכניקה בתוך הקרום כדורית אדומה שהם קריטיים לשלמות תא ותפקודו. 21
יש לנו עובדי מיקרוסקופיית שיטות (SPM), 22 כוללים AFM, 23 כדי לחקור את המבנה של האורות האדום קולטני אור הנקרא bacteriophytochromes (BphPs). 24,25 הם מורכבים של מודול חישת אור קוולנטית קשור למודול איתות-מפעיל כזה כקינאז היסטידין (HK). 26 מודול אור החישה בדרך כלל מכיל chromophore בלעין, שעובר שינוי מבני על קליטה של פוטון, עם שורה של שינויים מבניים שהגיעו למודול איתות-מפעיל ומוביל לשינוי גלובלי של כל החלבון . 24,27-29 בהתבסס על השינוי הזה, יש שני של אור מובחן קליטהtates של BphPs, מדינת אור קליטה אדומה ומרחיקה אדומה, מסומן כPr וPFR. Pr הוא מדינה יציבה תרמית, כהה מותאם עבור רוב BphPs. 28 הבסיס המולקולרי של photoconversion Pr / PFR אינו מובן לחלוטין בשל ידע מבני מוגבל של החלבונים האלה. למעט מבנה אחד מד radiodurans, 30 כל המבנים קריסטלוגרפיים רנטגן שפורסם של חלבונים אלה נמצאים במצב הכהה מותאמת וחסרי תחום מפעיל. BphPs שלם הם גדול מדי כדי להיחקר ביעילות על ידי תהודה מגנטית גרעינית (NMR) וקשה לשמצה להתגבש בצורה שלמה שלהם (במיוחד במדינה מותאמת האור) לקריסטלוגרפיה רנטגן. לאחרונה BphPs כבר מהונדס כסמני חלבון פלואורסצנטי אינפרא אדום (של IFP). ביום 31 באפיון מבני של חלבונים אלה יכול לקדם את הסיוע בעיצוב IFP יעיל. 32-36
המוקד של מאמר זה הוא להציג הליךהדמיה של BphPs באמצעות AFM נוזל תאים באמצעות PF-QNM. השיטה באה לידי ביטוי במחקרים של המדינה מותאמת אור RpBphP3 bacteriophytochrome (P3) מחיידק הפוטוסינתזה ר ' palustris. הליך AFM מוצג כאן הוא גישה נוחה וישירה להדמיה של חלבונים, כמו גם מקרומולקולות ביולוגיות אחרות. בשיטה זו, פרטים מבניים של מולקולות בודדות יכולים להיות שנאספו בפרק זמן קצר, בדומה למפגש מעבדה קורס במדע ברמה עליונה. דרך מדידת חתכים והשלמת ניתוחים ממדיים נוספים, ניתן להשוות נתונים ניסיוניים למודלים חישוביים שימושיים. 37-42
Protocol
Representative Results
Discussion
AFM הוא שיטת מיקרוסקופיית מסוגלת הדמיה חלבונים ומקרומולקולות ביולוגיות אחרות בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית באופן מלא. בהשוואה לקריסטלוגרפיה רנטגן וNMR, מגבלה אחת של AFM היא חוסר יכולתה כדי להשיג את אותה הרזולוציה, במיוחד ברזולוציה לרוחב. בעת השימוש בAFM לנתח מולקול…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תכנית NSF-MRI (מל"ג: 1,229,103) הוא הודתה למימון הרכישה של מוצרי אלקטרוניקה חדשות שליטה, תוכנה, תאים נוזליים, ושאר ציוד הדרוש כדי להרכיב AFM / STM כפול. אנו מכירים במתקנים המשותפים באוניברסיטת שיקגו תכנית NSF-MRSEC (DMR-0,820,054) לקבלת סיוע עם מכשור AFM, הכשרה, והדמיה, ועל זמן מכשיר שהועמדו על ידי אמצעי רשת חומרי המחקר (DMR-0,820,054). אנחנו במיוחד מודים לד"ר Qiti גואו, ד"ר ג'סטין Jureller, ופרופ 'קה איי לי לברכה לתלמידים שלנו לפני המימון של הצעת NSF-MRI שהביאה את המכשור הדרוש לקמפוס שלנו. אנו מכירים במימון ממענק הכותרת III גזע (ID: P031C110157) הוענק לאוניברסיטת אילינוי צפון מזרח שסיפק מלגות קיץ מחקר לסטודנטים ואנשי סגל, כמו גם תמיכה באספקה מתכלה. לבסוף, אנו מכירים ברוקר-Nano, Inc לתמיכה אינסטרומנטלית המשיכה ורשות reproduce עלילה מציגה את המנגנון של PeakForce QNM ולהשתמש במילה ScanAsyst לתאר את התוכנה האוטומטית.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
| NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
| MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| Multimode 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipped with Nanoscope V controller and J scanner |
| Probe | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
| Tapping Mode Fluid Cell | Bruker-Nano | MTFML | |
| Mica V-4 Grade | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
| Sample support disk | nanoSurf | BT02236 | |
| Petri dish | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| micropipettors | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | Prepared according to cited references | ||
| Nanoscope software | Bruker-Nano | ||
| Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
| Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
| 1 ml syringe | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf tubes | Denville Scientific | C2171 | |
| The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |
References
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
- Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. Atomic-Resolution Microscopy in Water Science. 232, 211-213 (1986).
- Nikiforov, M. P., Darling, S. B. Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM. J. Vis. Exp. 71, (2013).
- Bahatyrova, S. The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane. Nature. 430, 1058-1061 (2004).
- Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes. Biochem. 48, 3679-3698 (2009).
- Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).
- Viani, M. B. Probing Protein-Protein Interactions in Real-Time. Nature: Structural Biology. 7, 644-648 (2000).
- Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances. ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).
- Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (53), (2011).
- Poggi, M. A. Scanning Probe Microscopy. Anal. Chem. 76, 3429-3444 (2004).
- Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution. Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).
- Foster, B. The State of Microscopy for 2012. Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).
- Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid. ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).
- Kaemmer, S. B. Introduction to Bruker’s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology. , (2011).
- Dufrêne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve–based AFM. Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).
- Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy. Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).
- Berquanda, A. Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells. Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).
- Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells. J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).
- Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability. ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).
- Tobias, F. G. Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light. Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).
- Sorenson, B. A. Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy. Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).
- Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra. Plant Cell. 18, 4-14 (2006).
- Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).
- Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion. Biochem. 46, 4164-4176 (2007).
- Noack, S., Lamparter, T. Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis. Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).
- Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. Phytochrome structure and signaling mechanisms. Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).
- Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore. Nature. 414, 776-779 (2001).
- Takala, H. Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors. Nature. 509, 245-248 (2014).
- Filonov, G. S. Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging. Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).
- Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins. J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).
- Lehtivuori, H. Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans. J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).
- Toh, K. C. Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy. J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).
- Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein. J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).
- Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).
- . The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1. , .
- Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).
- Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).
- Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca. The FASEB Journal. 25, 928 (2011).
- Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution. J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).
- Wagner, J. R. Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes. J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).
