Microscopie à force atomique de Red-Light photorécepteurs Utilisation de l'association PeakForce quantitative nanomécanique propriété

Microscopie à force atomique (AFM) est devenu un outil très important pour l'étude des propriétés structurales et mécaniques des surfaces, couches minces, et des molécules simples depuis son invention en 1986 (Figure 1). ^1-3 Utilisation d'une cellule de liquide, la méthode a devenir particulièrement utile dans les études des macromolécules biologiques et même de cellules vivantes dans un environnement physiologiquement pertinents. ^4-10 Tapping mode AFM a traditionnellement été utilisé pour l'imagerie des tissus mous ou des molécules faiblement liées à la surface, car le contact en mode AFM est généralement inadaptés en raison de pour les dommages causés par les forces latérales exercées sur l'échantillon par la console. ¹¹ Tapping mode AFM permet de réduire considérablement ces forces en ayant la pointe intermittence toucher la surface plutôt que d'être en contact permanent. Dans ce mode, le cantilever est amené à osciller à ou près de sa fréquence de résonance normale à la surface. De même pour communiquer avec mode AFM, la topographie est analyzed en traçant le mouvement de la piézo-z comme une fonction de xy (distance).

La dynamique en porte à faux peuvent être très instable à ou près de résonance; par conséquent, ils sont très difficiles à automatiser l'extérieur d'une situation dite de «stabilisation». Plus précisément, ces dynamiques dépendent à la fois les propriétés de l'échantillon et de l'environnement de la numérisation. Pour une molécule doux adsorbé à un (re) surface dure, une boucle de rétroaction bien réglé pour la molécule peut engendrer un retour oscillation de la surface. Fonctionnement en fluide complique encore la mise au point de la poutre. Changements dans les niveaux de température ou fluides exigent un réajustement constant de point de consigne, les gains, et d'autres paramètres d'imagerie. Ces ajustements ont tendance à prendre beaucoup de temps et très difficile pour les utilisateurs.

Property Mapping pic de travail quantitative nanomécanique (PF-QNM), comme le mode de percussion AFM, d'éviter les interactions latérales en contactant par intermittence l'échantillon (Figure 2). ^{12-15 <}/ Sup> Toutefois, PF-QNM fonctionne en mode et fréquences beaucoup plus basses que-tapping mode AFM non-résonance. Ceci élimine les problèmes de réglage de mode taraudage AFM, en particulier ceux exacerbé par la présence de fluide. Avec PF-QNM, les images sont recueillies en prenant une courbe de réponse de la force à chaque point de contact. Avec l'ajout de logiciels de ScanAsyst, ¹⁵ réglage des paramètres de numérisation peut être automatisée et une image à haute résolution obtenue dans une affaire de minutes, même par des utilisateurs inexpérimentés. Une fois que l'utilisateur se familiarise avec l'AFM, tout ou partie des paramètres automatiques peuvent être désactivées à tout moment qui permet à l'expérimentateur d'affiner la qualité de l'image manuellement. Depuis sa création, le PF-QNM a été appliquée à la carte bactériorhodopsine, une protéine de la membrane, et d'autres protéines natives au niveau submoléculaire. ^16-18 Pour bactériorhodopsine, il existe une corrélation directe entre la flexibilité des protéines et X-ray structures cristallographiques. PF ¹² -qnM a été utilisée pour étudier des cellules vivantes avec une résolution élevée. ^19,20 liens importants outre, les données PF-QNM a élucidés entre la structure et la mécanique dans la membrane des érythrocytes qui sont critiques pour l'intégrité et la fonction des cellules. ²¹

Nous avons utilisé la microscopie à sonde à balayage (SPM) méthodes, ²² y compris AFM, ²³ pour étudier la structure des photorécepteurs aux feux rouges appelé bactériophytochromes (BphPs). ^24,25 Ils se composent d'un module de détection de lumière lié de façon covalente à un module de signalisation effecteur tel comme l'histidine kinase (HK) ^26. Le module de détection de lumière comprend généralement un chromophore bilin qui subit une transformation structurelle lors de l'absorption d'un photon, avec une série de modifications structurelles qui atteignent le module de signalisation de l'effecteur et conduisant à une transformation globale de la protéine entière . ^24,27-29 base de cette transformation, il ya deux lumière distincte absorbant stats de BphPs, un état absorbant la lumière rouge et rouge lointain, désignés comme Pr et Pfr. Pr est thermiquement stable, état ​​adapté à l'obscurité pour la plupart des BphPs. ²⁸ La base moléculaire de Pr / Pfr photoconversion n'est pas entièrement comprise en raison de la connaissance structurelle limitée de ces protéines. A l'exception d'une structure de D. radiodurans, tous les ³⁰ rayons X publiée structures cristallographiques de ces protéines sont dans l'état adapté à l'obscurité et manquent de domaine effecteur. Les BphPs intacts sont trop gros pour être étudié de manière efficace par résonance magnétique nucléaire (RMN) et sont notoirement difficiles à cristalliser dans leur forme intacte (en particulier dans l'Etat de lumière adapté) pour la cristallographie aux rayons X. BphPs ont récemment été conçu en tant que marqueurs de protéines fluorescentes infrarouge (IFP). ³¹ Caractérisation structurale de ces protéines peut favoriser l'aide à la conception IFP efficace. ^32-36

Est l'objet de cet article de présenter une procédure pourde formation d'image à l'aide de l'AFM BphPs liquide-cellule par l'intermédiaire de PF-QNM. La méthode est démontrée par des études de l'état de lumière adaptée de la bactériophytochrome RpBphP3 (P3) de la bactérie photosynthétique R. palustris. La procédure de l'AFM approche présentée ici est simple et commode pour l'imagerie de protéines ainsi que d'autres macromolécules biologiques. Avec cette méthode, les détails de structure des molécules individuelles peuvent être collectées dans un court laps de temps, similaire à une session de cours de science de laboratoire de niveau supérieur. Grâce à la mesure de sections et de compléter d'autres analyses dimensionnelles, les données expérimentales peuvent être comparés à des modèles informatiques utiles. ^37-42