Atomic Force Microscopy van Red-Light Fotoreceptoren behulp PeakForce Kwantitatieve Nanomechanical Property Mapping

Atomaire kracht microscopie (AFM) is uitgegroeid tot een zeer belangrijk instrument voor het onderzoeken van de structurele en mechanische eigenschappen van oppervlakken, dunne films en enkele moleculen sinds de uitvinding in 1986 (figuur 1). ^1-3 Met behulp van een vloeistof-cel, de methode heeft worden bijzonder bruikbaar in studies van biologische macromoleculen en zelfs levende cellen in een fysiologisch relevante omgeving. ^4-10 Tapping mode AFM is van oudsher gebruikt voor beeldvorming van zachte materialen of zwak gebonden moleculen aan het oppervlak, via contact-mode AFM doorgaans ongeschikt wijten om de schade veroorzaakt door de zijdelingse krachten op het monster door de cantilever. ¹¹ Tapping-modus AFM aanzienlijk vermindert deze krachten door het hebben van de tip met tussenpozen raak het oppervlak in plaats van constant in contact. In deze modus wordt de cantilever geoscilleerd of nabij zijn resonantiefrequentie loodrecht op het oppervlak. Net als bij contact-modus AFM, topografie is analeyzed getrokken waarbij de beweging van de z-piëzo als functie van xy (afstand).

De cantilever dynamiek kan heel instabiel zijn op of in de buurt van resonantie; daarom zijn ze zeer uitdagend om buiten een "steady-state" situatie automatiseren. Specifiek deze dynamiek afhankelijk zowel het monster eigenschappen en scanomgeving. Voor een zachte molecuul geadsorbeerd aan een vaste (re) oppervlak kan een goed afgestelde terugkoppellus voor het molecuul leiden tot feedback oscillatie van het oppervlak. Operatie in vloeistof verder compliceert de tuning van de cantilever. Veranderingen in temperatuur of vocht niveaus vereisen constante aanpassing van setpunt, winsten, en andere imaging parameters. Deze aanpassingen hebben de neiging om zeer tijdrovend en uitdagend voor de gebruikers zijn.

Peak Force Kwantitatieve Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM), zoals mode AFM tikken, voorkomt laterale interacties door intermitterend contact van het monster (figuur 2). ^{12-15 <}/ Sup> Echter, PF-QNM actief in niet-resonante mode en frequenties veel lager dan tikken-modus AFM. Dit elimineert de stemming uitdagingen tappen-mode AFM, met name verergerd door de aanwezigheid van vocht. Met PF-QNM, worden de beelden verzameld door het nemen van een kracht responscurve op elk punt van contact. Met de toevoeging van ScanAsyst software, kan ¹⁵ aanpassing van de scan parameters worden geautomatiseerd en de afbeelding met een hoge resolutie in een kwestie van minuten, verkregen door zelfs onervaren gebruikers. Zodra de gebruiker wordt meer vertrouwd met de AFM, kan elke of alle geautomatiseerde parameters geactiveerd op elk tijdstip waarop de experimentator de beeldkwaliteit handmatig maakt fijnafstelling. Sinds haar ontstaan ​​heeft de PF-QNM toegepast op bacteriorhodopsin, een membraaneiwit, en andere inheemse eiwitten in kaart op het submoleculaire niveau. ^16-18 Voor bacteriorhodopsin, is er een direct verband tussen eiwit flexibiliteit en röntgenkristallografische structuren. ¹² PF -QNM is gebruikt om levende cellen met hoge resolutie onderzocht. ^19,20 Verder is PF-QNM data toegelicht belangrijke verbanden tussen structuur en mechanica binnen de erytrocyt membraan die essentieel zijn voor cel integriteit en functie. ²¹

We hebben scanning probe microscopie (SPM) methoden, ²² waaronder AFM, ²³ de structuur van rood licht fotoreceptoren genoemd bacteriophytochromes (BphPs) bestuderen. ^24,25 Ze bestaan ​​uit een lichtgevoelige module covalent gebonden aan een signaal-effector module dergelijke histidine kinase (HK). ²⁶ Het licht-sensing module bevat typisch een bilin chromofoor welke structurele verandering ondergaat bij absorptie van een foton met een reeks structurele veranderingen bereiken van de signalering effector-module en leidt tot een algemene verandering van het gehele eiwit . ^24,27-29 basis van deze transformatie, zijn er twee verschillende lichtabsorberende sTates van BphPs, een rood en ver-rood licht absorberen staat, aangeduid als Pr en Pfr. Pr thermisch stabiel, donker aangepaste toestand voor de meeste BphPs. ²⁸ De moleculaire basis van Pr / Pfr photoconversion niet volledig begrepen vanwege de beperkte kennis van deze structurele eiwitten. Met uitzondering van een structuur van D. radiodurans, ³⁰ alle gepubliceerde röntgenkristallografische structuren van deze eiwitten zijn in het donker aangepaste toestand en missen effector domein. Het intacte BphPs zijn te groot om effectief bestudeerd door Nuclear Magnetic Resonance (NMR) en zijn notoir moeilijk te kristalliseren in de intacte vorm (met name in het licht aangepaste state) voor röntgenkristallografie. BphPs zijn onlangs ontworpen als infrarood fluorescerend eiwit markers (IFP). ³¹ Structurele karakterisering van deze eiwitten kan helpen bij het ​​effectief IFP ontwerp verder. ^32-36

De focus van dit artikel is om een ​​procedure in te dienen voorbeeldvorming van BphPs gebruik van vloeibare-cel AFM via PF-QNM. De methode wordt aangetoond door studies van het licht aangepaste toestand van de bacteriophytochrome RpBphP3 (P3) van de fotosynthetische bacterie R. palustris. De AFM procedure hier gepresenteerde gemakkelijk en ongecompliceerd benadering voor beeldvorming van eiwitten en andere biologische macromoleculen. Met deze methode kan structurele details van afzonderlijke moleculen te halen in een korte periode van tijd, vergelijkbaar met een hoger niveau science cursus laboratoriumsessie. Door het meten van doorsneden en het invullen van verdere dimensionale analyses, kunnen experimentele gegevens worden vergeleken met bruikbare rekenmodellen. ^37-42