Bir Flow Koşullarında lökosit-endotel Etkileşimleri değerlendirilmesi<em> Ex vivo</em> Autoperfused Microflow Odası Deneyi
Summary
Burada, biz araştırmacı bir fare dolaşım sistemine endotel kaynaklı yapışma molekülleri ile kaplanmış bir odayı bağlayarak lökosit işe dinamikleri ex vivo değerlendirmek için izin veren bir protokol mevcut. Göreceli biyolojik şartlar altında lökosit değerlendirme sağlar, bu yöntem önemli avantajlar sunar.
Abstract
Lökosit-Endotelyal etkileşimler, akut ve kronik iltihap erken ve kritik olaylar ve bozulmuş zaman, daimi patolojik hasarına yol açan doku hasarı aracılık edebilir. Mevcut konvansiyonel testler sadece kan lökosit çıkarma sonra lökosit adezyon moleküllerinin analiz izin. Bu periferik kan lökosit (PBL'ler) da araştırma bulgularını etkileyen PBLs teşvik, hangi analiz için hazır olabilir önce birkaç adım geçmesi kan gerektirir. autoperfused mikro akış odası deneyi, ancak, bilim adamları bir kaplanmış odasını manipüle özgürlüğü yerken canlı fare sistemik akışını kullanarak fonksiyonel düzensizliği erken lökosit çalışma sağlar. Bir hastalık modeli sayesinde, lökosit adezyon moleküllerinin fonksiyonel ifadesi değerlendirilebilir ve immobilize endotel adezyon molekülleri ex vivo ile kaplanmış bir mikro-cam odasında sayısal. Bu modelde, kan akarodasında yerli BBL'lerin etkileşimini sağlayan sağ karotis arter ve anestezi altında canlı farenin sol eksternal juguler ven arasında. Gerçek zamanlı deneysel analiz intravital mikroskop yardımı olarak bir Harvard Apparatus basınç aracı ile birlikte sağlanır. Cam odasının giriş noktasında bir akış regülatörü uygulama deneyleri arasında karşılaştırılabilir fizyolojik akış koşulları izin verir. Lökosit haddeleme hızı, ana sonuçtur ve Sağlık açık erişim yazılımı ImageJ Ulusal Enstitüleri ile ölçülür. Özetle, autoperfused mikro akış odası tahlil Lökositler endotel etkileşimi incelemek için optimal fizyolojik bir ortam sağlar ve inflamasyonu okuyan zaman araştırmacılar doğru sonuçlara varmak için izin verir.
Introduction
Enflamasyon yaralanma vücudun evrensel bir yanıttır ve hem doğal ve adaptif bağışıklık sistemi fonksiyonu çok önemli bir adımdır. Yaralanma ve / veya iltihap uyarıcıya tepki olarak endotelial hücreler, belirli bir yapışma moleküllerini arttırdığı; Bu öncelikle sonrası kılcal venüllerdeki, mikrovasküler endotel ile ekstravazasyon lökosit yol açar. Bu süreç endotel üzerindeki kan dolaşımında serbest akan lökositlerin tethering ile başlar. Kararlı haddeleme ve sırayla tenasühe ve sitotoksik ajanların salgılanmasına yol açar lökositlerin, firma yapışma, bu 1,2 tethering izleyin. Selektinler kademeli 3-5 erken aşamaları neden olduğu bilinmektedir; integrinlerinin firması yapışması ve göçü 1,6-8 sonraki adımlar için sorumludur.
Kanıt artan vücut iskemi reperfüzyon hasarı hayvan modellerinde lökosit ve endotel adezyon molekülleri sahip hayati rolleri önerir, Astım, psöryazi, multipl skleroz, ve yaşla ilişkili maküler dejenerasyon 9-12. Bu koşullar altında, inflamatuvar yanıt sağlıklı doku yıkımında ortaya çıkan, kişinin kendi bedenini saldırmaya yanlış yönlendirilmiş olduğunu. (Örneğin, non-steroid anti-enflamatuar ilaçlar, kortikosteroidler ya da diğer kemoterapötik maddeler olarak) mevcut anti-enflamatuar maddeler, uzun süreli kullanım 13 ile ciddi yan etki riskini taşırlar. Bu nedenle, bu toksik olmayan 14 kalarak sonuçta istenen anti-inflamatuar etkiye sahip hedeflenebilir hastalığa özgü molekülleri tespit yeteneği, uygun araçlara sahip büyük ilgi olduğunu.
Statik lökosit yapışma deneyi olarak in vitro yöntemler mevcut erken 1976 15 olarak kullanıldı. Paralel akış bölmesi, birinci akış şartları altında, lökosit-endotel etkileşimlerini incelemek için 1987, in vitro olarak kullanılmıştır. Bu deneylerde, Huma uyarılmışn, toplardamar kanından polimorfonükleer lökositler (PMNler), primer insan göbek damar endotelial hücrelerinde (HUVECler) bir tek tabaka içinde perfüze edildi. Hemodinamik akış koşulları kontrol etmek için, Harvard Apparatus şırınga pompası 16 kullanılmıştır. Seçenek olarak ise, yapay lökosit izolasyonu önlemek için, tam kan, immobilize edilmiş yapışma moleküllerinin 17 ile kaplanmış cam bölme ile bir arada kullanılmıştır.
Lökosit stimülasyonu önlemek ve mekanistik yaklaşık fizyolojik koşullar altında yapışma molekülleri ile etkileşimi incelemek için, bir ex vivo autoperfused, ekstrakorporel, arteriyovenöz devre 16 geliştirilmiştir. Bu devrede, kan tek ya da birlikte immobilize yapışma molekülleri ile kaplanmış bir cam Mikrosirkülasyon bölme içinde doğal BBL'lerin etkileşimi sağlayan, anestezi altında canlı bir farenin sağ ortak karotid arter ve sol dış boyun toplardamarı arasına akar. Bu Sistemli için önemli bir avantajm, enflamatuar yollar doğrudan ya da dolaylı olarak manipüle edildiği genetik olarak fareler kullanmak yeteneğidir. Ayrıca, akış koşulları altında, dış aktivasyon serbest inflamasyon lökosit adezyon molekülleri, izole katkı saptamak için yeteneği var. Akış odasının giriş noktasında bir akış regülatörü uygulama arteriyel veya venöz sistemleri 18-22 ya taklit etmek kesme kuvvetlerinin deneysel varyasyonları geniş bir yelpazede sunmaktadır. Burada detaylı olarak ex vivo autoperfused Mikrosirkülasyon odası testinin hazırlanması ve performansı ile ilgili bir protokol açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
lökosit işe süreci inflamatuvar yanıt çok önemli bir adımdır; Bu onların efektör işlevini yerine getirmesini mümkün hedef dokulara doğru dolaşım sistemi için lökositlerin migrasyonunu içerir. Lökositin görevlendirilmesi, aterosklerotik istilanın, miyokardiyal enfarktüs, iskemi / reperfüzyon ve transplant ameliyatını 1, hem de birden çok merkezi sinir sistemi ile ilgili nöro-enflamatuar durumların 10-12,20,24,25 gibi inflamatuar olaylardaki çeşitli ayrılmaz bir parçasıdır. Lökosit işe açıklıklı, autoperfused Mikrosirkülasyon odası araştırmacı lökosit göç dinamiklerini incelemek için yeteneği sağlayan vazgeçilmez bir aracı sağlar hastalık koşulları çeşitliliğini göz önüne alındığında.
Son birkaç on yıl boyunca, in vitro tahlillerin çeşitli lökosit hücre yapışmasının 26 dinamikleri üzerinde çalışmak üzere geliştirilmiştir. Ne yazık ki, bu tahlillerin tümüne çıkarılmasını gerektirirkandan lökositler, mekanik aktivasyon tanıtan. In vivo ortamda yakın olsun, uyarlamalar tam kan örnekleri toplamak ve hemodinamik akış koşulları 16,17 kontrol yapılmıştır. Burada, biz fare dolaşım sistemine kaplanmış odayı bağlayarak alanında önceki avans. Biz bir fizyolojik aralık kan akışını düzenleyen ve lökosit haddeleme dinamiklerini incelemek mümkün. kaplanmış odası bize belirli yapışma molekülleri ile lökosit etkileşimleri çalışmak için yeteneği verir. Sistem, canlı fare tarafından işletilen bir birim olarak görev olduğu için, daha yakından bize immünolojik fare modellerinde çeşitli lökosit-endoteliyal etkileşimler üzerinde çalışmak için izin doğal çevreye taklit eder. Ayrıca, bu sistem bize mevcut çoklu genetik fare modellerinin yararlanmak için izin verir. Sistem tamamen in vivo ortamda çoğaltma değil iken, specifi incelemek için bir platform sağlarfizyolojik koşullar altında lökositlerin c elemanları, daha önce mümkün olmayan bir başarı. Bu bir adım daha yakın, daha fizyolojik bir ortamda bizi alır olsa sisteme sınırlamalar vardır. Biz odası kaplama sınırlıdır lökosit etkileşimlerinin bazı unsurları değerlendirmek için sadece edebiliyoruz, böylece tamamen damar karmaşık 3D matrisi çoğaltma değil. Buna ek olarak, büyük bir dikkatle protokolde belirtilen tüm adımları fare dolaşımı için bir kapalı sistem sağlamak için dikkatli olunmalıdır. Hava kabarcıklarının giriş ölçüde deney doğruluğunu ve tekrarlanabilirlik etkileyecektir.
Biz lökosit haddeleme dinamikleri değerlendirmek için Autoperfused Microflow odanın kullanımını tarif ederken prosedür çeşitli hastalıkları çalışma araştırmacılar tarafından kişiselleştirilmiş bir potansiyele sahiptir. Örneğin, kanser hücreleri, lökositler tarafından paylaşılan ortak integrinler çok ifade metastaza. Studying daha yakından bilgi yardımcı olabilecek bir in vivo ortamı taklit eden bir ortamda, ve bazı kanser hücrelerinin invaziv doğası muhtemelen tahmin, onların haddeleme dinamiği. Olası metotlardan biri, GFP ifade eden kanser hücrelerinin haddeleme dinamikleri parça akış odası deneyi ile birlikte böyle bir GFP 27 kanser hücreleri için bir etiketleme tekniği birleştirmek olabilir. Bu prosedür, genetiği değiştirilmiş fareler ve hastalık modelleri ile birlikte diğer laboratuarlarda kullanılmak üzere modifiye nasıl görmek ilginç olacak maddelerin çeşitli odasına kaplanması ve aynı fare birden odaları bağlayan esnekliği göz önüne alındığında. Biz burada açıklamak tekniği sadece sadece araştırmacı yaratıcılığı ile sınırlıdır çok daha geniş bir uygulama potansiyeline dokunur.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R01EY022084 / S1 (KMC), T32EY007145 (HS) ve P30EY014104: Bu yayında bildirilen araştırma ödülü numaraları altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Göz Enstitüsü tarafından desteklendi. içerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Ek destek Massachusetts Lions Göz Araştırma Fonu (KMC) ve (KMC için) önleyin Körlük için Research Özel Scholar Ödülü tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Material | Vendor | Part number |
| Micro glass chamber 0.4×0.04x50mm | VitroCom | 2540-050 |
| Polyethylene tubing PE 10 | Fisher Scientific | 427400 |
| Polyethylene tubing PE 60 | Fisher Scientific | 427416 |
| Silicone tubing 002 | Fisher Scientific | 11-189-15A |
| Y tube | Value Plastics | Y210-6 |
| T tube | value plastics | T410-6 |
| Silicone gel | Hardware store – Home Depo | |
| 35mm petri dish | Corning | 430165 |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM996 |
| Fine forceps | FST | 11253-25 |
| Fine scissors | FST | 15000-08 |
| Tube holder | FST | 00608-11 |
| Clamp applicator | FST | 18057-14 |
| Vascular clamp | FST | 18055-04 |
| 6-0 silk sutures | George Tiemann & Co | 160-1215-6/0 |
| 25x1G needles | BD | 305125 |
| 30×1/2G needles | BD | 305106 |
| Heparin 100 USP units/ml | Hospital pharmacy |
References
- Barreiro, O., Sanchez-Madrid, F. Molecular basis of leukocyte-endothelium interactions during the inflammatory response. Revista Espanola de Cardiologia. 62, 552-562 (2009).
- Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24, 327-334 (2003).
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinion in Cell Biology. 20, 525-532 (2008).
- Mehta, P., Cummings, R. D., McEver, R. P. Affinity and kinetic analysis of P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1. The Journal of Biological Chemistry. 273, 32506-32513 (1998).
- Nicholson, M. W., Barclay, A. N., Singer, M. S., Rosen, S. D., vander Merwe, P. A. Affinity and kinetic analysis of L-selectin (CD62L) binding to glycosylation-dependent cell-adhesion molecule-1. The Journal of Biological Chemistry. 273, 763-770 (1998).
- Sandig, M., Negrou, E., Rogers, K. A. Changes in the distribution of LFA-1, catenins, and F-actin during transendothelial migration of monocytes in culture. Journal of Cell Science. 110 (22), 2807-2818 (1997).
- Shaw, S. K., et al. Coordinated redistribution of leukocyte LFA-1 and endothelial cell ICAM-1 accompany neutrophil transmigration. The Journal of Experimental Medicine. 200, 1571-1580 (2004).
- Woodfin, A., et al. JAM-A mediates neutrophil transmigration in a stimulus-specific manner in vivo: evidence for sequential roles for JAM-A and PECAM-1 in neutrophil transmigration. Blood. 110, 1848-1856 (2007).
- Blankenberg, S., Barbaux, S., Tiret, L. Adhesion molecules and atherosclerosis. Atherosclerosis. 170, 191-203 (2003).
- Parmeggiani, F., et al. Mechanism of inflammation in age-related macular degeneration. Mediators of Inflammation. 2012, 546786 (2012).
- Ding, X., Patel, M., Chan, C. C. Molecular pathology of age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 28, 1-18 (2009).
- Xu, H., Chen, M., Forrester, J. V. Para-inflammation in the aging retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28, 348-368 (2009).
- Peterson, K., et al. Drug Class Review: Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs (NSAIDs): Final Update 4 Report. Drug Class Reviews. , (2010).
- Ulbrich, H., Eriksson, E. E., Lindbom, L. Leukocyte and endothelial cell adhesion molecules as targets for therapeutic interventions in inflammatory disease. Trends in Pharmacological Sciences. 24, 640-647 (2003).
- Stamper, H. B., Woodruff, J. J. Lymphocyte homing into lymph nodes: in vitro demonstration of the selective affinity of recirculating lymphocytes for high-endothelial venules. The Journal of Experimental Medicine. 144, 828-833 (1976).
- Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion. Blood. 70, 1284-1290 (1987).
- Abbitt, K. B., Nash, G. B. Characteristics of leucocyte adhesion directly observed in flowing whole blood in vitro. British Journal of Haematology. 112, 55-63 (2001).
- Smith, M. L., Sperandio, M., Galkina, E. V., Ley, K. Autoperfused mouse flow chamber reveals synergistic neutrophil accumulation through P-selectin and E-selectin. Journal of Leukocyte Biology. 76, 985-993 (2004).
- Yuan, J., Melder, R. J., Jain, R. K., Munn, L. L. Lateral view flow system for studies of cell adhesion and deformation under flow conditions. BioTechniques. 30, 388-394 (2001).
- Moalem, G., et al. Autoimmune T cells protect neurons from secondary degeneration after central nervous system axotomy. Nature Medicine. 5, 49-55 (1999).
- Hafezi-Moghadam, A., Thomas, K. L., Cornelssen, C. A novel mouse-driven ex vivo flow chamber for the study of leukocyte and platelet function. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 286, 876-892 (2004).
- Almulki, L., et al. Surprising up-regulation of P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) in endotoxin-induced uveitis. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 929-939 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Rapalino, O., et al. Implantation of stimulated homologous macrophages results in partial recovery of paraplegic rats. Nature Medicine. 4, 814-821 (1998).
- Yoles, E., et al. Protective autoimmunity is a physiological response to CNS trauma. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 3740-3748 (2001).
- Buchanan, M. R., Vazquez, M. J., Gimbrone, M. A. Arachidonic acid metabolism and the adhesion of human polymorphonuclear leukocytes to cultured vascular endothelial cells. Blood. 62, 889-895 (1983).
- Connor, K. M., et al. Manganese superoxide dismutase enhances the invasive and migratory activity of tumor cells. Cancer Res. 67, 10260-10267 (2007).
