La evaluación de las interacciones leucocito-endotelio en condiciones de flujo en un<em> Ex Vivo</em> Ensayo Autoperfused Cámara Microflow

Todos los experimentos con animales se manejan de acuerdo con la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research, y las directrices y normas establecidas por el Massachusetts Eye and Ear Infirmary Comité de Cuidado de Animales. El día antes del experimento: 1. Preparación de la Tubería de la cámara de flujo Para preparar el lado yugular, conecte 1 cm tubo de polietileno PE10 a un tubo de silicio 6 cm, seguido de tubo de polietileno de 5 cm. Por el lado de la carótida, preparar de manera similar a la parte yugular con la adición de un tubo en T en el tubo de silicona 6 cm aproximadamente 1,5 cm de distancia del tubo de polietileno de 1 cm (Figura 1A, B). Con el fin de insertar el tubo en T, ampliar el tubo de silicona mediante el uso de unas pinzas finas si es necesario. Conecte un extremo de 10 cm de tubo de silicona para el transductor de presión a continuación, inserte el extremo T del s carótidaide T-tubo en el otro extremo. Asegúrese de que la conexión de los sitios estén apretadas y sin fugas. Aplicar una pequeña pieza rectangular de Parafilm sobre el lugar donde el tubo encaja, si es necesario, para evitar fugas (Figura 1C). 2. El recubrimiento de la Cámara Preparar la proteína de revestimiento de la superficie endotelial (por ejemplo, P selectina, molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1), vascular proteína-1 de adhesión celular (VCAM-1)) en 0,1% de BSA. Como pauta, 1 g de proteína en 200 l de BSA es suficiente para recubrir 4-5 cámaras. Usando una jeringa de 1 ml conectada a una aguja de 25 G, en infusión cada cámara (0,04 x 0,4 x 50 mm) con la proteína de recubrimiento de la superficie endotelial. Guarde las cámaras recubiertas en un tubo de 15 ml a 4 ° C durante la noche. El día del experimento: 3. Preparación de la Cámara Retire las cámaras revestidas de 4 ° C y conectar la tubería yugular y carótida para cada lado. Sellar las connections estirando con cuidado una pequeña pieza rectangular de parafina sobre el lugar donde la tubería cumple con la cámara. Con una jeringa, llenar la cámara y el tubo con 0,1% de BSA (compruebe si hay fugas). Incubar durante 45 min. Preparar una placa de Petri de 35 mm para mantener la cámara mediante la reducción de muescas en cada lado del plato. Estabilizar la cámara en las muescas; a continuación, utilizar una pequeña gota de silicona para fijar la cámara al plato en el sitio dentada. Asegúrese de que la cámara está nivelada mirando bajo el microscopio. Deje que la silicona se seque por lo menos 15 minutos. Llene una jeringa de 60 ml de bloqueo con heparina y conectar con el transductor de presión. Conectar el transductor de presión a la tubería de la carótida en el siguiente orden: Transductor, tubo de silicona, y T-tubo. Utilice un PE50 1 cm entre el tubo de silicona conectado al transductor y el tubo en T para asegurar la conexión. Pase el tubo de silicona de la arteria carótida a través de la pinza de presión (Figura 1D). Ejecute 100USP heparina excelentes referenciasugh el tubo y la cámara hasta que no queden burbujas de aire. 4. Configuración del Software Para preparar el software, encienda la computadora, un microscopio y un dispositivo de laboratorio abierto. Haga doble clic en la aplicación suite de Leica (LAS) (o equivalente) y preparar una carpeta para guardar el video: ver → → adquieren película → definir secuencia de clips (clips = 15, tiempo de grabación = 30 seg, y los intervalos = 15 seg) a continuación, haga clic en el signo "+" para confirmar. Para registrar la presión del flujo de abrir el LabChart (o equivalente) de archivos y coordinar el nombre del archivo a la carpeta de grabación en el paso 4.1, arriba. 5. Procedimiento Quirúrgico Anestesiar un 8-10 semanas de edad de ratón usando una combinación de ketamina (60 mg / kg) y xilazina (6 mg / kg) inyectado por vía intraperitoneal (IP). Confirme que la sedación profunda se logra dentro de 5 a 10 minutos por la pérdida de reflejo de retirada pedal. Si es necesario, isofluranoemitido a través de la mascarilla se puede dar cuando sea necesario. Mientras que bajo anestesia, coloque una almohadilla de calentamiento debajo de la jaula y se puso a 37 ° C para mantener la temperatura corporal. Una vez confirmada la anestesia adecuada, coloque el ratón en una posición ventral y el abrigo de los ojos con el ungüento de bacitracina para evitar la sequedad ocular. A partir de entonces, afeitar el pelo en el sitio de la incisión con una cuchilla de afeitar y limpiar a fondo el sitio con alcohol. Una vez totalmente anestesiado asegurar el animal con cinta manteniendo el ratón en una posición ventral. Exponer la zona del cuello con unas tijeras y extirpar la glándula tiroides para exponer la tráquea y los vasos (Figura 2). Limpie la arteria carótida hasta que esté totalmente expuesta con cuidado de no dañar el nervio vago (Figura 2B). Dobla un pedazo de sutura y pasar la curva debajo de la arteria carótida luego se corta en la curva por lo que ahora hay 2 piezas de sutura debajo de la carótida. Loop cada sutura en nudos (no apriete elnudos). Repetir el mismo procedimiento para exponer la vena yugular izquierda (Figura 2C), la preparación de las suturas de la misma manera (Figura 2D). Conecte el tubo a la vasculatura del ratón. Heparinizar el ratón mediante la inyección de 1 ml de heparina IP. Apretar la sutura superior en la arteria carótida. Coloque la abrazadera buque un precio tan bajo como puede ir en la arteria carótida (Figura 3A). El uso de fórceps para mantener la arteria por la sutura superior y hacer una pequeña incisión, de aproximadamente 1/8 de la circunferencia de la arteria, utilizando las microtijeras (Figura 3B). Pase el tubo de la arteria carótida a través de la segunda nudo en la sutura superior y en la incisión realizada en la arteria. Tie fuera de la sutura inferior de modo que la arteria se sella alrededor de la tubería (se deben hacer varios nudos para asegurar un sello hermético; Figura 3C). Repita el mismo procedimiento para insertar el tubo vena yugular (el vasopinza no es necesario para el lado yugular; Figura 3D). Pruebe el flujo por la liberación de la abrazadera del buque. Si no hay fugas de mover el ratón para el microscopio y conectar la tubería de la carótida y la vena yugular a la tubería de cámara (ver video adjunto para la demostración de procedimiento quirúrgico). 6. Grabación del balanceo de velocidad Abra la abrazadera de la carótida para llenar la cámara, haciendo un circuito con el sistema circulatorio del ratón. Dejar que la sangre circule durante 3-5 minutos para que se estabilicen las condiciones de flujo. Durante el período de espera de 3-5 min, ajuste la platina del microscopio de manera que la cámara está a nivel de un extremo a otro con el objetivo del microscopio y su borde es paralelo a la ventana de grabación de vídeo en la pantalla. Llene la placa de Petri modificado que contiene la cámara de vidrio con agua y luego bajar el objetivo de inmersión en agua 10 veces en el plato de manera que las células que fluyen a través de la cámara son visibles.La intensidad de la luz puede tener que ser ajustada para una visualización adecuada de las células. En general una menor intensidad es mejor. Ajustar la pinza del tubo de modo que el transductor lee una constante 30 mm Hg, correlacionando a una presión de flujo fisiológico medio, o como se desee. Pulse "Inicio" para iniciar la grabación tanto el video como la presión con el primer lapso de tiempo cerca del final yugular y en movimiento contra el flujo hacia el final de la carótida hasta que se complete. NOTA: Varias condiciones de revestimiento utilizando diferentes moléculas de adhesión pueden ser estudiados en el mismo ratón mediante el uso de múltiples cámaras. Sólo una de las cámaras se graba en un momento. Cuando se termina la grabación, cerrar la válvula en el sitio de entrada, detener el flujo de sangre. Retire la cámara y adaptarse a una nueva cámara (recubierto con una molécula de adhesión diferente) al circuito usando pinzas finas en una mano y fórceps ranurados en la otra mano. Reanudar la grabación de la nueva cámara como se indica en los pasos06.01 a 06.04. La eutanasia de todos los ratones por asfixia con CO2 seguida de una dislocación de la médula espinal al final del experimento. El procedimiento se terminal, por lo tanto, los ratones se sacrificaron mediante una dislocación de la médula espinal al final del experimento. 7. Interpretación de los resultados Para analizar los datos registrados utilizan el plugin "M TrackJ" para el software ImageJ 23. Convertir el archivo en escala de grises Seleccione Archivo → Importar → → AVI convertir a escala de grises. Estandarizar los marcos Seleccione → Imagen → → propiedad por entrar en los intervalos de la trama (i) → global. Calcular los intervalos de la trama dividiendo la duración total de vídeo (normalmente 30 segundos) por el número de fotogramas en un vídeo (que se muestra en la esquina superior de la ventana de vídeo J Image). Medir el flujo de cada leucocitos por Seleccione el plugin → M TrackJ → Añadir pistas → seleccione un leucocito→ Seguir con cada fotograma durante 15 – 20 segundos → Fusionar. Repita el paso 7.4 para todos los leucocitos a la vista. Determinar la velocidad media rodar de los leucocitos de Select medida → dos columnas aparecen → Copiar todo de la M TrakJ: Orugas en una hoja de cálculo. La columna titulada "V significar" es la de leucocitos de rodadura medido en píxeles / segundo. Convertir en m / seg dividiendo por 2/3. Para analizar el punto culminante de datos de presión y exportación en una hoja de cálculo y realizar el siguiente cálculo:? P (mm Hg) y t (dinas / cm 2) para una comparación entre cada grupo experimental. Una vez calculado, copie los datos en el software de prisma para su representación gráfica.