Avaliando interação leucócito-endotélio em condições de fluxo em um<em> Ex Vivo</em> Autoperfused Microflow Câmara Assay

Todos os experimentos em animais foram tratados de acordo com a Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia Declaração de Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research, e as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Massachusetts Eye and Ear Infirmary Comitê Animal Care. O dia antes da experiência: 1. Preparação de tubulação para o fluxo Câmara Para preparar o lado jugular, conecte um centímetro PE10 tubo de polietileno de tubo de silicone 6 centímetros seguido por tubos de polietileno de 5 cm. Para o lado da carótida, preparar de modo semelhante ao lado jugular com a adição de um tubo em T dentro do tubo de silicone 6 centímetros a cerca de 1,5 cm de distância do tubo de polietileno com 1 cm (Figura 1A, B). A fim de inserir o tubo T, alargar o tubo de silicone utilizando uma pinça fina, se necessário. Ligue uma extremidade de 10 cm de tubo de silicone para o transdutor de pressão, em seguida, insira a extremidade T da carótida side tubo T para a outra extremidade. Assegurar a ligação sites são apertados e sem vazamento. Aplicar um pequeno pedaço rectangular de parafilme sobre o local onde o tubo se encaixa, se necessário, para evitar fugas (Figura 1C). 2. Revestimento da Câmara Preparar a proteína de revestimento de superfície endotelial (por exemplo, selectina P, molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1), proteína vascular-1 de adesão celular (VCAM-1)) em 0,1% de BSA. A título de orientação, 1 ug de proteína em 200 ul de BSA é suficiente para revestir 4-5 câmaras. Usando uma seringa de 1 ml ligada a uma agulha G 25, cada câmara de infusão (0,04 x 0,4 x 50 mm) com a proteína de revestimento de superfície endotelial. Armazenar as câmaras revestidos em um tubo de 15 ml a 4 ° C durante a noite. O dia do experimento: 3. Preparar a Câmara Retirar as câmaras revestidos de 4 ° C e ligar a tubagem jugular e carótida de cada lado. Sele as connections com cuidado esticar um pequeno pedaço rectangular de parafilm sobre onde a tubulação encontra a câmara. Usando uma seringa, encher a câmara e tubos com 0,1% de BSA (verificação de fugas). Incubar durante 45 min. Prepara-se uma placa de Petri 35 milímetros para manter a câmara de corte por ranhuras de cada lado do prato. Estabilize a câmara nos entalhes; em seguida, usar uma pequena gota de silicone para fixar a câmara para o prato no local dentada. Certifique-se que a câmara está nivelada por olhar sob o microscópio. Permitir que o silicone para secar durante pelo menos 15 min. Encha uma seringa de 60 ml de bloqueio com heparina e conecte-se o transdutor de pressão. Ligue o transdutor de pressão para a tubagem carótida na seguinte ordem: Transdutor, tubagem de silicone, e T-tubo. Use de 1 cm PE50 entre o tubo de silicone ligado ao transdutor e o tubo T, para fixar a ligação. Passar a tubagem de silicone da artéria carótida por meio do grampo de pressão (Figura 1D). Execute 100USP heparina through o tubo eo compartimento até que não haja bolhas de ar. 4. Instalação do Software Para preparar o software, ligue o computador, microscópio, e um dispositivo de laboratório aberto. Clique duas vezes sobre o conjunto de aplicativos Leica (LAS) (ou equivalente) e preparar uma pasta para guardar o vídeo: navegar → adquirir → filme → definir seqüência de clips (clips = 15, o tempo de gravação = 30 segundos, e intervalos = 15 sec) em seguida, clique no sinal de "+" para confirmar. Para gravar a pressão de fluxo abrir o LabChart (ou equivalente) do arquivo e coordenar o nome do arquivo para a pasta de gravação na etapa 4.1, acima. 5. Procedimento Cirúrgico Anestesiar um rato de 8-10 semanas de idade, utilizando uma combinação de cetamina (60 mg / kg) e xilazina (6 mg / kg), injectada intraperitonealmente (IP). Confirme se a sedação profunda é alcançada dentro de 5-10 min por perda do reflexo interdigital. Se necessário, o isofluranopor máscara pode ser dado como necessário. Enquanto sob anestesia, coloque uma almofada de aquecimento por baixo da gaiola e configurada para 37 ° C para manter a temperatura corporal. Uma vez que a anestesia adequada é confirmada, coloque o mouse em uma posição ventral e revestir os olhos com bacitracina pomada para evitar a secura ocular. Em seguida, raspar o cabelo no local da incisão usando uma lâmina de barbear e limpe o local com álcool. Depois de completamente anestesiado prender o animal com fita mantendo o mouse em uma posição ventral. Expor a área do pescoço com uma tesoura e remover a glândula tireóide para expor a traqueia e os vasos (Figura 2A). Limpe a artéria carótida até que esteja totalmente exposto tomando cuidado para não danificar o nervo vago (Figura 2B). Dobre um pedaço de fio de sutura e passar a curva debaixo da artéria carótida em seguida, corte na curva de forma que há agora dois pedaços de sutura debaixo da carótida. Loop cada sutura em nós (não aperte oknots). Repetir o mesmo procedimento para expor a veia jugular esquerda (Figura 2C), preparando-se as suturas da mesma maneira (Figura 2D). Conecte o tubo para a vasculatura mouse. Heparinizar o mouse através da injeção de 1 ml de IP heparina. Apertar a sutura superior na artéria carótida. Coloque o grampo do navio tão baixo quanto ele pode ir na artéria carótida (Figura 3A). Use pinça para segurar o fio de sutura pela artéria superior e fazer uma pequena incisão, cerca de 1/8 da circunferência da artéria, utilizando a microtesoura (Figura 3B). Passar a tubagem artéria carótida através do segundo nó da sutura superior e para dentro da incisão feita na artéria. Amarrar a sutura inferior de modo a que a artéria é fechada hermeticamente em torno do tubo (vários nós devem ser tomadas medidas para garantir uma vedação estanque; Figura 3C). Repetir o mesmo procedimento para a inserção do tubo de veia jugular (o vasobraçadeira não é necessária para o lado jugular; Figura 3D). Teste o fluxo liberando a braçadeira navio. Se não há vazamentos mover o mouse para o microscópio e se conectar a tubulação carótida ea veia jugular à tubulação câmara (veja o vídeo em anexo para demonstração do procedimento cirúrgico). 6. Gravação de rolamento Velocity Abrir o grampo carótida para encher a câmara, fazendo com que um circuito com o sistema circulatório do rato. Permitir que o sangue circule para 3-5 min, de modo que as condições de fluxo estabilizar. Durante o período de espera de 3-5 minutos, ajustar a fase de microscópio de modo que a câmara é nível de uma extremidade para a outra com o objectivo de microscópio e o seu bordo é paralela com a janela de gravação de vídeo na tela. Encher o prato de Petri contendo modificado da câmara de vidro com água, em seguida, baixar a objectiva de imersão em água 10X para o prato de modo a que as células fluem através da câmara são visíveis.A intensidade de luz pode ter que ser ajustada para uma visualização adequada das células. Geralmente uma intensidade menor é melhor. Ajustar o grampo no tubo de modo que o transdutor lê uma constante 30 mm Hg correlacionando a uma pressão média de fluxo fisiológico, ou como desejado. Pressione "iniciar" para iniciar a gravação, tanto o vídeo e a pressão com o primeiro lapso de tempo perto do final jugular e move contra o fluxo para a extremidade carótida até concluída. NOTA: Várias condições de revestimento utilizando diferentes moléculas de adesão pode ser estudado no mesmo rato usando várias câmaras. Apenas uma câmara é registada em cada vez. Quando a gravação terminar, fechar a válvula no local de entrada, interrompendo o fluxo de sangue. Remover a câmara e encaixar uma nova câmara (revestido com uma molécula de adesão diferente) para o circuito utilizando uma pinça fina em um lado, e uma pinça com ranhuras na outra mão. Retomar a gravação para a nova câmara, conforme descrito nas etapas6,1-6,4. Eutanásia todos os ratinhos por asfixia com CO 2, seguida por um deslocamento da medula espinal, no final da experiência. O procedimento é terminal, por conseguinte, os ratinhos são sacrificados por luxação da medula espinal, no final da experiência. 7. Interpretação dos Resultados Para a análise dos dados gravados usar o plugin "M TrackJ" para software ImageJ 23. Converta o arquivo em tons de cinza Selecione o arquivo de importação → → → AVI converter em tons de cinza. Padronizar os quadros Select → imagem → propriedade → por introduzir os intervalos de quadro (i) → global. Calcular os intervalos de quadro dividindo a duração total video (normalmente 30 segundos) ao número de quadros num vídeo (mostrado no canto superior da janela de vídeo J Imagem). Medir o fluxo de cada leucócitos por Select plug-in → M TrackJ → Adicionar faixas → selecionar um dos leucócitos→ Acompanhe-o com cada quadro de 15-20 seg → Mesclar. Repita o passo 7.4 para todos os leucócitos em vista. Determine a velocidade média de rolamento dos leucócitos da Select medida → duas colunas aparecem → copiar todos os M TrakJ: Trilhas em uma planilha. A coluna denominada "V dizer" é o rolamento de leucócitos medido em pixels / segundo. Converter em um / sec dividindo por 2/3. Para analisar o destaque de dados de pressão e de exportação em uma planilha e executar o seguinte cálculo: AP (mm Hg) e t (dina / cm 2) para uma comparação entre cada grupo experimental. Uma vez calculada, copiar os dados para software prisma para a representação gráfica.