におけるフローの状況の下で白血球 - 内皮相互作用を評価する<em>エクスビボ</em> Autoperfusedマイクロフローチャンバーアッセイ

動物実験はすべてビジョンの研究のための協会に従って処理し、眼科及び視覚研究における動物の使用のための眼科声明、およびマサチューセッツ州アイと耳診療所動物管理委員会によって定められたガイドラインおよび規制された。 実験前日： フローチャンバ用チューブの調製頸静脈側を製造するために、5cmのポリエチレン管に続いて6センチメートルシリコンチューブに1cmのPE10ポリエチレンチューブを接続します。頚動脈側については、約1.5cm離れた1cmのポリエチレンチューブは6センチシリコンチューブ内のT字管の添加により頚側と同様に調製した（ 図1A、B）。 T字管を挿入するために、必要に応じて、微細なピ​​ンセットを使用してシリコンチューブを広げる。 頚動脈sのT側を挿入する、圧力変換器にシリコンチューブの10cmの一端を接続しIDEのT字管の他の端に。接続サイトが締まっていることを確認し、自由に漏れ。必要に応じて、漏れ（ 図1C）を防止するために、チューブが一緒に収まるどこオーバーパラフィルムの小さな長方形の部分を適用します。 2.会議所のコーティング 0.1％BSAに内皮表面コートタンパク質（ 例えば、Pセレクチン、細胞間接着分子-1（ICAM-1）、血管細胞接着タンパク質-1（VCAM-1））を準備する。ガイドラインとして、タンパク質1μgの200μlのBSAが4-5室コートするのに十分です。 25 G針に接続された1mlシリンジを用いて、内皮細胞表面コートタンパク質と（0.04 xは0.4×50mm）の各チャンバに注入する。一晩4℃で15 mlのチューブで被覆された室に保管してください。 実験の日： 商工会議所の準備3. 4℃からコーティングされたチャンバーを取り外し、各側に頸静脈とチューブを接続します。 connectiをシール慎重にチューブは、チャンバを満たしている場所の上パラフィルムの小さな長方形の部分を延伸することにより、ONS。注射器を使用して、0.1％のBSA（漏れをチェックする）とチャンバとチューブを埋める。 45分間インキュベートする。 皿の両側にノッチを切断することにより、チャンバを保持するために35ミリメートルペトリ皿を準備します。ノッチ内のチャンバを安定させる。その後ノッチサイトの皿にチャンバーを固定するために、シリコンの小滴を使用しています。チャンバーは顕微鏡下で見ることによってレベルであることを確認してください。シリコーンは、少なくとも15分間乾燥することができます。 ヘパリンと60ミリリットルのロック注射器を記入し、圧力変換器に接続します。トランスデューサ、シリコンチューブ、およびT字管：次の順序で頚動脈チューブに圧力トランスデューサを接続します。 トランスデューサーとの接続を確保するためのT字管に接続されたシリコンチューブの間に1cmのPE50を使用してください。圧力クランプ（ 図1D）を介して頸動脈のシリコンチューブを渡します。ファイル名を指定して実行100USPヘパリンのthro気泡がなくなるまでのチューブとチャンバーぐふ。 4.ソフトウェアのセットアップソフトウェアを準備するために、コンピュータ、顕微鏡、およびオープンラボデバイスの電源を入れます。ダブルライカアプリケーションスイート（LAS）（または同等品）をクリックし、ビデオを保存するフォルダを準備します。→取得→映画をブラウズ→クリップのシーケンス（クリップ= 15、記録時間= 30秒、との間隔= 15秒）を定義するその後確認のため、「+」記号をクリックします。 流れ圧力が上記の、 ステップ4.1で記録フォルダにファイル名をLabChart（または同等の）ファイルを開き、座標記録するには。 5.手術手順ケタミンの組み合わせた（60mg / kg）およびキシラジン（6ミリグラム/ kg）を用いて、8-10週齢のマウスを麻酔する腹腔内（IP）注射した。深い鎮静がペダル引っ込め反射の喪失により5〜10分以内に達成されることを確認してください。必要に応じて、イソフルラン必要に応じて、フェイスマスクを介して送達を挙げることができる。 麻酔下の間、ケージの下で加温パッドに置き、体温を維持するために37℃に設定。適切な麻酔が確認されると、眼の乾燥を防ぐために、バシトラシン軟膏で腹位置し、コート目にマウスを置く。 その後、カミソリの刃を使用して切開部位の毛を剃ると徹底的にアルコールでサイトをクリーニングします。 一度完全に麻酔をかけたテープが腹の位置でマウスを保持したまま動物を確保する。はさみで首の領域を露光し、気管や血管（ 図2A）を露出するために甲状腺を取り除く。 それは完全に迷走神経（ 図2B）を損傷しないように注意しながら露出するまで頚動脈を清掃してください。縫合糸の一部を折り、その後頸動脈の下に縫合糸の2個存在することになりますので、曲がりで切断頸動脈の下に曲がりを渡す。ループノットに各縫合糸（締めないでくださいノット）。 同様（ 図2D）で縫合糸を準備し、左頸静脈（ 図2C）を露出するために同じ手順を繰り返します。 マウスの血管系にチューブを接続します。 ヘパリンIP 1mlの注射することによってマウスをHeparinize。 頸動脈の上限縫合糸を締めます。それは頸動脈（ 図3A）に行くことができると低く、血管クランプを置きます。 microscissors（ 図3B）を使用して、小切開、動脈の円周の約1/8を上限縫合することにより動脈を保持し、作るために鉗子を使用してください。 上部の縫合糸にし、動脈に切開内に第2の結び目を通して頚動脈チューブを渡します。動脈がチューブの周りでシールされるように、下縫合糸を縛る（; 図3C、いくつかの結び目が密封を確実にするためになされるべきである）。 （頸静脈チューブを挿入するための容器を同じ手順を繰り返しますクランプは、頸静脈側には必要ありません; 図3D）。 血管クランプを解放することによって、フローをテストします。漏れがない場合は、顕微鏡にマウスを移動し、（手術手技のデモンストレーションのために添付のビデオを参照）、チャンバチューブに頸動脈管と頸静脈に接続します。 6.録音ローリング速度マウスの循環系を有する回路を作る、室を埋めるために頸動脈クランプを開きます。流れの状態が安定するように、血液が3-5分間循環させています。チャンバは、顕微鏡対物レンズとの一端から他端までのレベルがあり、その縁部がスクリーン上で録画窓と平行になるように3〜5分間の待機期間中は、顕微鏡のステージを調整する。 チャンバを通って流れる細胞が見えるように皿に10×水浸対物レンズを下げ、次に水でガラス容器を含む改変ペトリ皿を埋める。光強度は、細胞の適切な表示のために調整されなければならない。一般的に低い強度が優れています。 トランスデューサはメディア生理的な流れ圧力に相関する、安定した30ミリメートルHgのを読み取るように、または必要に応じて、チューブのクランプを調整します。 ビデオと頸静最後に近く、完成するまで、頸動脈端に向かって流れに逆らって移動する第1の時間経過に伴う圧力の両方の記録を開始するために押して「スタート」。 注：異なる接着分子を用いていくつかのコーティング条件は、複数のチャンバを用いて同じマウスで研究することができる。唯一つのチャンバは、一度記録されている。 記録が終了すると、血液の流れを停止、入力部位で弁を閉じる。チャンバーを取り外し、他の手で片手に細かい鉗子と溝付き鉗子を用いた回路に（別の接着分子でコーティングされた）新しいチャンバーにフィット。 手順で説明したように新しい室の記録を再開6.1から6.4。 実験の終了時に脊髄脱臼に続いてCO 2窒息によりすべてのマウスを安楽死させる。手順は、したがって、マウスは、実験の終了時に、脊髄脱臼により安楽死させ、端末である。 7.結果の解釈分析するに記録されたデータはImageJソフトウェア23は「M TrackJ」プラグインを使用する。 [ファイル]→[インポート]→[AVI→グレースケールに変換することでグレースケールにファイルを変換します。 →グローバル→フレーム間隔（i）を入力するプロパティ→選択→イメージでフレームを標準化。 （画像Jビデオウィンドウの上隅に表示）1ビデオのフレーム数によって合計ビデオ再生時間（通常は30秒）を分周してフレーム間隔を計算します。 セレクトプラグインによって各白血球の流れを測定→M TrackJは→トラックを追加→白血球を選択20秒→マージ – →15各フレームでそれを追跡します。 ビュー内のすべての白血球を繰り返し手順7.4。 2列がコピー→M TrakJのすべてが表示され選択→措置により、白血球の平均転がり速度を決定します。スプレッドシートに追跡します。 "Vを意味する」と記された列は、ピクセル/秒で測定された白血球のローリングです。 2/3で割ることにより、ミクロン/秒に変換します。 各実験群間の比較のためにΔP（mmHgで）とT（ダイン/ cm 2）：スプレッドシートに圧力データのハイライトと輸出を分析し、次の計算を実行するには。計算された後は、グラフ作成のためのプリズムソフトウェアにデータをコピーします。